snt 2729-2010 马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７２９—２０１０马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊（犠犪犾犾狉．）犎狌犵犺犲狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７２９—２０１０前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫

2、局。本标准主要起草人：刘伟、刘会梅、封立平、王秀芬、姜丽、王有福、董薇。Ⅰ犛犖／犜２７２９—２０１０马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法１范围本标准规定了进境马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定。２术语和定义下列术语和定义适用于本文件。２．１块茎狋狌犫犲狉地下茎末端肥大成块状，适应储藏和越冬的变态茎。２．２分生孢子盘犪犮犲狉狏狌犾狌狊由基质表面突起的盘状菌丝块结构，其上生出密集的短分生孢子梗，分生孢子梗之间常生有刚毛。２．３刚毛狊犲狋犪犲一

3、种较坚硬的毛状物，常壁厚，且颜色较暗。２．４菌核狊犮犾犲狉狅狋犻狌犿菌核是由菌丝紧密交织而成的休眠体，内层是疏丝组织，外层是拟薄壁组织，表皮细胞壁厚、色深、较坚硬。菌核的功能主要是抵抗不良环境。但当条件适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体。２．５附着孢犪狆狆狉犲狊狊狅狉犻狌犿植物病原真菌孢子萌发形成的芽管或菌丝顶端的膨大部分，可以牢固地附着在寄主体表面，其下方产生侵入钉穿透寄主角质层和表层细胞壁。３原理３．１马铃薯炭疽病菌的分类地位马铃薯炭疽病菌犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊（

4、Ｗａｌｌｒ．）Ｈｕｇｈｅｓ的中文名称为“墨色刺盘孢”。犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿为子囊菌、小丛赤壳属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）的无性型。根据《ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＦｕｎｇｉ》第９版，犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿分类地位为真菌界，有丝分裂孢真菌Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃｆｕｎｇｉ。３．２检疫和鉴定原理马铃薯块茎被马铃薯炭疽病菌侵染后出现圆形的病斑，在马铃薯块茎、匍匐茎、根、地上及地下茎变色的部位都能形成大量黑色的小菌核。本标准以该病菌在马铃薯块茎上的主要危害症状、形态学特征以及ＰＣＲ反应特性为鉴定马铃薯炭疽病菌的

5、主要依据。马铃薯炭疽病菌的形态特征及背景资料参见１犛犖／犜２７２９—２０１０附录Ａ。４仪器设备和用具４．１仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、体式显微镜、生物显微镜、冰箱、ＰＣＲ仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、台式小型离心机、Ｍｉｎｉ离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外反射透射仪、低温冰箱（－８０℃）、凝胶成像系统、研磨珠均质器、空层析柱、天平（感量０．００１ｇ）。４．２用具白瓷盘和尖头镊子、可调微量加样器、液氮罐、ＰＣＲ反应管、研钵、玻璃珠、螺帽管、培养皿、离心管、酒精灯、

6、三角瓶（５０ｍＬ，１００ｍＬ）、量筒（５００ｍＬ）、载玻片（２５．３ｍｍ×７６．２ｍｍ）、盖玻片（１８ｍｍ×１８ｍｍ）、手术刀、手术剪、镊子、ｐＨ计、塑料袋、离心管等。５试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂：次氯酸钠、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、三氨基甲烷、ＥＤＴＡ、酚、异戊醇、氯化钾、４种脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）、溴化乙锭（ＥＢ）、ＲＮａｓｅ酶、蛋白酶Ｋ、ＢＳＡ、ＰＶＰＰ、ＰＶＰ、异丙醇、三氯甲烷、饱和酚、巯基乙醇、山梨糖、溴酚蓝、硫酸氨、ＣＴＡＢ、ＢｉｏｌａｓｅＤｉａｍｏｎｄ、ＳＤＳ、葡萄糖

7、凝胶ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５、多聚半乳糖醛酸ＰＧＡ、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、山梨糖。抗菌剂：五氯硝基苯ＰＣＮＢ、苯菌灵、硫酸链霉素、四环素盐酸、氯霉素、红霉素、硫酸新霉素、扑海因、氯苯密醇、乙烯菌核利。１×ＴＢＥ缓冲液、上样缓冲液、ＴＥ缓冲液、菌丝体ＤＮＡ提取缓冲液、均质缓冲液、土壤和块茎ＤＮＡ提取缓冲液ＳＰＣＢ、１×ＰＣＲ反应缓冲液。６现场检疫６．１抽样６．１．１抽样方法以批为抽样单位，无批号的以品种为抽样单位。每份样品的抽样点不少于５个，随机抽取。单位包装只能有一个抽样点。６．１．２抽样数量５００粒以下取一

8、份；５０１粒～２０００粒取两份；２００１粒～５０００粒取三份；５００１粒～１００００粒取四份；１０００１粒以上，每增加１００００粒增取一份，不足１００００粒的余量，计取一份。每份样品２０粒块茎。６．２查验按进口马铃薯块茎总件数的５％～２０％随机抽检，最低抽检数量不少于１０件，且不少于１０００粒。根据马铃薯炭疽病在马铃薯块茎上的特有症状特点进行视觉检验（必要时使用放大镜观察），在光线充足