snt 2797-2011 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 mpcr-dhplc法

《snt 2797-2011 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 mpcr-dhplc法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７９７—２０１１食品中致泻大肠埃希氏菌检测犕犘犆犚犇犎犘犔犆法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犱犻犪狉狉犺犲犪犵犲狀犻犮犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻犻狀犳狅狅犱—犕犘犆犚犇犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７９７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局、中华人民

2、共和国黑龙江出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：徐君怡、曹际娟、郑秋月、王顺芝、高小博、李苏龙、李建民、王秋艳、赤列加措。Ⅰ犛犖／犜２７９７—２０１１食品中致泻大肠埃希氏菌检测犕犘犆犚犇犎犘犔犆法１范围本标准规定了食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ检测方法。本标准适用于食品中致泻性大肠埃希氏菌，包括肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌的ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ快速检测。２规范性引用文件下列文件对于本

3、文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ４７８９．６食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ０９７３进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检验方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＭＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）：

4、多重ＰＣＲＤＨＰＬＣ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）：变性高效液相色谱ＴＥＡＡ：三乙基铵乙酸盐４生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照ＧＢ１９４８９的有关规定执行。５废弃物处理和防止污染的措施５．１检测过程中的废弃物需经１２１℃高压灭菌处理至少３０ｍｉｎ后再弃置。５．２检测过程中防止交叉污染的措施参照标准ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定执行。６原理多重ＰＣＲ，又称多重引物ＰＣＲ或复合ＰＣＲ，它是在同一ＰＣＲ反应体系里加上两对以上引

5、物，同时１犛犖／犜２７９７—２０１１扩增出多个核酸片段的ＰＣＲ反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般ＰＣＲ相同。ＤＨＰＬＣ分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对ＤＮＡ片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液（ＴＥＡＡ），核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与ＴＥＡＡ分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时ＴＥＡＡ分子中的三个乙基与固定相Ｃ１８表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。７试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯，水为灭菌超纯水。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的

6、容器分装。７．１水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。７．２犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。７．３ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。７．４１０×ＰＣＲ缓冲液：见Ａ．１．１。７．５引物：引物序列见表Ａ．１。７．６ＴＥ溶液：见Ａ．１．２。７．７１０％ＳＤＳ。７．８蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。７．９氯化钠溶液（ＮａＣｌ）：５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。７．１０１０％ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化胺）。７．１１三氯甲烷。７．１２异戊醇。７．１３酚。７．１４异丙醇。７．１５７０％乙醇。７．１６ＤＨＰＬＣ缓冲液：见Ａ．１．３。７．１７双料缓冲蛋白胨

7、水：见Ａ．１．４。８主要仪器和设备８．１ＰＣＲ仪。８．２ＤＨＰＬＣ仪。８．３离心机（离心转速１８０００犵）。８．４ＰＣＲ超净工作台。８．５微量可调移液器和灭菌吸头：２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１０００μＬ。８．６灭菌ＰＣＲ反应管。９方法提要与检测程序９．１方法提要本方法采用四重ＰＣＲ同时扩增四种致泻性大肠埃希氏菌。四重ＰＣＲ产物再利用ＤＨＰＬＣ非变性条件下的ＤＮＡ分离技术，根据ＤＮＡ扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从２犛犖／犜２７９７—２０１１而对食品中致泻性大肠埃希氏菌进行快速检测。９．２检测程序食品中致

8、泻大肠埃希氏菌ＭＰＣＲＤＨＰＬＣ检测的流程图见图１。图１犕犘犆犚犇犎犘犔犆法检测食品中致泻大肠埃希氏菌流程图１０操作步骤１０．１样品制备、增菌培养