snt 2773-2011 国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法 属通用引物基因悬浮芯片法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７３—２０１１国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法犚犪狆犻犱狊犻犿狌犾狋犪狀犲狅狌狊狊犮狉犲犲狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犳犻狏犲犫犻狅狋犲狉狉狅狉犻狊犿犫犪犮狋犲狉犻犪犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋—犌犲狀犲狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔狑犻狋犺狌狀犻狏犲狉狊犪犾狆狉犻犿犲狉狊狅狀犵犲狀狌狊犾犲狏犲犾２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７７３—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的

2、规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：杨宇、张晓龙、孙肖红、王惠兰、张乐、王静、杨永莉。Ⅰ犛犖／犜２７７３—２０１１国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法１范围本标准规定了用于国境口岸快速筛查炭疽芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犪狀狋犺狉犪犮犻狊，犅．犪）、鼠疫耶尔森菌（犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊，犢．狆）、布鲁菌（犅狉狌犮犲犾

3、犾犪ｓｐｐ．，犅狉狌）、土拉弗朗西斯菌（犉狉犪狀犮犻狊犲犾犾犪狋狌犾犪狉犲狀狊犻狊，犉．狋）和类鼻疽伯克霍尔德菌（犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉犻犪狆狊犲狌犱狅犿犪犾犾犲犻，犅．狆）五种重要生物恐怖病原菌的基因悬浮芯片筛查方法。本标准适用于国境口岸发现的可疑物品或环境样品中五种重要生物恐怖病原菌的筛查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１５５２国境口岸生物

4、因子恐怖事件监测规程ＷＳ２３３微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１生物恐怖病原菌犫犻狅狋犲狉狉狅狉犻狊犿犫犪犮狋犲狉犻犪可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。３．２基因悬浮芯片犵犲狀犲狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔利用带编码的微球体作为载体

5、，流式细胞仪作为检测平台，对核酸进行大规模测定的一种生物芯片技术。４生物安全防护要求４．１排查前做好个人防护。防护方法和标准见ＳＮ／Ｔ１５５２。４．２实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ２）实验室的生物安全要求。４．３使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。１犛犖／犜２７７３—２０１１５主要设备与试剂５．１主要设备悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、ＰＣＲ仪、生物安全柜、移液器、核酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。５．２主要试剂ＬＢ液体培养基（见

6、Ａ．１）、ＬＢ固体培养基（见Ａ．２）、ＤＳＭ芽孢培养基（见Ａ．３）、ＰＣＲ反应预混液（见Ａ．４）、氯化四甲铵（ＴＭＡＣ）、１．５×ＴＭＡＣ杂交液（见Ａ．５）、１×ＴＭＡＣ杂交液（见Ａ．６）、羧基化编码微球、２［犖吗啉］乙磺酸（ＭＥＳ）、１（３二甲氨基丙基）３乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、ＳＤＳ、犖十二烷基肌氨酸钠、链亲和素藻红蛋白（ＳＡＰＥ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、６ｍｏｌ／Ｌ碘化钠（ＮａＩ）、玻璃粉、７０％乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚、三氯甲烷、吐温２０。６检测方法６．１样品采集依ＳＮ／Ｔ１５５２执行。６．２

7、细菌犇犖犃提取６．２．１取０．１ｇ样本加５００μＬＰＢＳ（见Ａ．８），１０００犵离心３ｍｉｎ；取上清液，１２０００犵离心１ｍｉｎ，弃去上清液。６．２．２沉淀用ＰＢＳ洗涤３次后，向每管样本中加入６ｍｏｌ／Ｌ碘化钠１００μＬ，振荡混匀３０ｓ，煮沸３０ｍｉｎ，间或混匀。６．２．３将上述煮沸处理的样本于１００００犵离心５ｍｉｎ，将上清转至另一含５００μＬ２０％玻璃粉悬液的１．５ｍＬ离心（ＥＰ）管中。充分混匀，置室温１０ｍｉｎ，期间每２ｍｉｎ混匀１次，使暴露的ＤＮＡ吸附于玻璃粉上。６．２．４８０００犵离心２ｍｉｎ，小心倾去上清液。６．

8、２．５向玻璃粉ＤＮＡ沉淀中加入７５％乙醇１ｍＬ，充分混匀，洗涤玻璃粉，８０００犵离心２ｍｉｎ，小心倾去上清液。６．２．６重复洗涤一次后，８０００犵离心２ｍｉｎ并用吸头尽量吸干漂洗液，然后放置于３７℃恒温箱使彻底干燥。６．２．７向上述晾干的玻璃粉ＤＮＡ沉淀中加２０μＬＴＥ（见Ａ．７），充分