snt 2774-2011 国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７４—２０１１国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犫狔狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２７７４—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家

2、认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：王静、孙肖红、杨宇、杨永莉、胡孔新、文海燕。Ⅰ犛犖／犜２７７４—２０１１国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法１范围本标准规定了国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片检测方法，包括样品处理、检测方法、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的实验室检验。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不

3、注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部，２００６年）３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１鼠疫耶尔森菌犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊鼠疫菌为耶尔森菌属由假结核菌进化而来的新生病原体，革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的球杆菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。３．２鼠疫耶尔森菌犉１抗原犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犉１犪狀狋犻犵犲狀Ｆ１抗原是鼠疫菌的荚膜抗原，是鼠

4、疫菌于３７℃条件下在细胞壁外形成的一层厚凝胶状荚膜，是鼠疫菌主要的保护性抗原。人或动物感染鼠疫菌后，Ｆ１抗原在体内高度表达，具有明显抗吞噬和活化补体的作用。鼠疫菌Ｆ１抗原具有抗原性强、特异性高等特点，检测Ｆ１抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据，也是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一。３．３蛋白悬浮芯片狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔利用带编码的包覆荧光发色剂的微球为载体标定目标抗原或抗体，以报告分子（如：荧光染料）标记目标抗原或抗体，流式细胞仪作为检测平台，可以对抗原或抗体等生物分子进行大

5、规模检测的一种生物芯片技术。４仪器设备悬浮芯片系统１）、微孔滤板抽滤器、真空气泵、恒温振荡器、生物安全柜、离心机、荧光显微镜、超声波清洗器、恒温培养箱、纯水机、漩涡混合仪、血球计数板。１）Ｌｕｍｉｎｅｘ１００／２００或等效设备。１犛犖／犜２７７４—２０１１５主要试剂与耗材５．１试剂生物素标记试剂盒：ＢｉｏｔｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＳＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）２）或等效试剂盒，微球交联试剂盒：ＡｍｉｎｅＣｏｕ３）或等效试剂盒，悬浮芯片仪校准试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｂｉｏ

6、Ｒａｄ）４）或等ｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）效试剂盒，悬浮芯片仪校验试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＶａｌｉｄａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）５）或等效试剂盒６），兔抗鼠疫菌Ｆ１抗原抗体（或等效抗体），鼠疫Ｆ１抗原单抗２Ｆ６（或等效抗体），藻红蛋白标记链霉亲和素（ＳＡＰＥ），１（３二甲氨基丙基）３乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ），牛血清白蛋白（ＢＳＡ），犖羟基硫代琥珀酰亚胺（ＳｕｌｆｏＮＨＳ），鸡ＩｇＧ，兔抗鸡ＩｇＧ，羊抗兔ＩｇＧ，吐温２０。其他所需缓冲溶液配制及要求参见附录Ａ。５．２

7、耗材羧基化编码微球、９６孔滤板、消毒液：１０％的次氯酸钠溶液（含有效氯＞１０％）、悬浮芯片仪样品流路鞘液。６抗体包被编码微球和生物素标记抗体６．１活化编码微球６．１．１取１００μＬ编码微球到１．５ｍＬ离心管中，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．２加入１００μＬ的微球清洗缓冲液悬浮，振荡３０ｓ，超声３０ｓ，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．３加入１００μＬ的微球活化缓冲液，然后先加入１０μＬ新鲜配制的ＥＤＣ工作液，再加入１０μＬ新鲜配制的ＳｕｌｆｏＮＨＳ

8、工作液，高速振荡３０ｓ后用铝箔包裹，在室温１８℃～２５℃振摇２０ｍｉｎ。６．１．４加入１５０μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），振荡１０ｓ后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．５重复６．１．４步骤一次。６．１．６加入１００μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４）悬浮编码微球，中速振荡３０ｓ后，超声１５ｓ。６．２抗体包被编码微球６．２．１取溶于０．０３ｍｏｌ／ＬＰＢ缓冲液（ｐＨ７．２）兔抗Ｆ１抗体１２μｇ加入到活化后的编码微球中，用ＰＢＳ（ｐＨ７．４）定容至５００μＬ，铝箔包裹在室温