snt 1207-2011 猪痢疾检疫技术规范

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１２０７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１２０７—２００３猪痢疾检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊狑犻狀犲犱狔狊犲狀狋犲狉狔２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１２０７—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１２０７—２００３《猪痢疾短螺旋体分离培养操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１２０７—２００３相比，主要技术变化如下：———增加了猪痢疾临床诊断及疾病概述相关技术内容；———增加了患病猪大肠组织切片镜检操作方法内容；—

2、——修改、完善了猪痢疾短螺旋体分离培养和鉴定方法，细化了采样方法与检测程序；———增加了猪痢疾短螺旋体的ＰＣＲ检测鉴定方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、华中农业大学。本标准主要起草人：陈建军、郭明星、曾宪东、金梅林、张四喜、黄晟、冯汉利、赵晖、徐家文、张春亚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１２０７—２００３。Ⅰ犛犖／犜１２０７—２０１１猪痢疾检疫技术规范１范围本标准规定了猪痢疾病的临床诊断、组织切片镜检及猪痢疾短螺旋体分离培养和鉴定方法。本标准适用于猪痢疾病的检疫诊断。２规范性引用文

3、件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ１９４９５．３转基因产品检测核酸提取纯化方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＳＤ（ｓｗｉｎｅｄｙｓｅｎｔｅｒｙ）：猪痢疾Ｂ．ｈ（ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）：猪痢疾短螺旋体Ｂ．ｉ（ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｉｎｎｏｃｅｎｓ）：非致病性短螺旋体Ｂ．ｐ（ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ）：结肠菌毛样短螺旋体

4、４临床诊断猪只感染ＳＤ后所表现出的临床、病理症状大多较为典型，对于本病的检疫可结合猪群的流行病学、临床症状及病理解剖检验的结果对猪只是否感染本病作出初步的诊断，具体方法参见附录Ａ。５实验室诊断５．１大肠组织切片镜检５．１．１材料准备５．１．１．１器材：组织切片机、生物显微镜、染色缸、水浴锅、恒温培养箱、载玻片。５．１．１．２试剂：１０％福尔马林、７０％乙醇、９５％乙醇、无水乙醇、二甲苯、切片石蜡、革兰氏染色液或姬姆萨染色液。５．１．２样品采集与处理５．１．２．１剖检病猪，取病变大肠段（盲肠、结肠和直肠前段），冷藏送检。２左右病变大肠段样品置１０％福尔马林中至少固定３ｈ～４ｈ

5、。５．１．２．２切取１ｃｍ１犛犖／犜１２０７—２０１１５．１．２．３取出样品用流水冲洗１ｈ。５．１．２．４将样品依次浸入３９℃的９５％乙醇、无水乙醇中，各脱水３０ｍｉｎ。５．１．２．５再将脱水后的样品浸入３８℃的二甲苯中，透明１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。５．１．２．６取透明样品依次浸入５６℃的二甲苯石蜡（体积比＝１∶１）１０ｍｉｎ、二甲苯石蜡（体积比＝１∶３）２０ｍｉｎ和液体石蜡中３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ，进行浸蜡包埋。５．１．２．７用切片机切片，并将组织切片贴于洁净载玻片上，置５６℃温箱２ｈ～３ｈ或３８℃温箱中过夜烘干，备染。５．１．２．８取烘干切片样品依次浸入两缸二甲苯中脱蜡

6、，各３ｍｉｎ～５ｍｉｎ。５．１．２．９再依次放入无水酒精、９５％和７０％酒精中浸泡２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，取出用流水润洗。５．１．２．１０用革兰氏染色液染色，干燥，再用二甲苯透明一次，用盖玻片封片备检。或以１０倍稀释的姬姆萨染色液浸染脱蜡切片样品８ｈ～２４ｈ，再迅速通过两缸无水乙醇，干燥，二甲苯透明，封片备检。５．１．３镜检镜检观察，ＳＤ阳性病猪病料可在粘膜表面特别是在结肠腺窝内见到大量的Ｂ．ｈ样菌体，Ｂ．ｈ为革兰氏阴性，长６μｍ～８．５μｍ，呈舒展的２～４个螺旋状，两端尖锐的蛇样菌（参见附录Ｂ）。５．２猪痢疾短螺旋体的分离培养和鉴定５．２．１材料准备５．２．１．１器材：生物显

7、微镜、载玻片、厌氧培养箱（罐）（２０％ＣＯ２、８０％Ｈ２）、离心机、灭菌注射器、手术刀、止血钳、缝合针、线、灭菌棉拭子。５．２．１．２试剂：ＢＪ培养基、磷酸缓冲液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．２ＰＢＳ）（配制方法见附录Ｃ）、革兰氏染色液或姬姆萨染色液。５．２．１．３试验动物：仔猪（１５ｋｇ～２５ｋｇ）或豚鼠（３周龄～４周龄）或幼小鼠（２０ｇ左右）。５．２．２病料采集处理与分离培养５．２．２．１采集直肠或新鲜粪便拭子样品，置入装有适量ＰＢＳ的灭菌试管内，密封后０℃～４℃保存送检，３ｄ内进行分离培养检验；对于病死猪或扑