snt 2328-2009 化妆品急性毒性的角质细胞试验

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３２８—２００９化妆品急性毒性的角质细胞试验犆狅狊犿犲狋犻犮狊犪犮狌狋犲狋狅狓犻犮犻狋狔狅犳犽犲狉犪狋犻狀狅犮狔狋犲犮狔狋狅狋狅狓犻犮犻狋狔狋犲狊狋２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２３２８—２００９前言本标准附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｄ是规范性附录，附录Ｃ是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中

2、华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３２８—２００９化妆品急性毒性的角质细胞试验１范围本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测。本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于受试物质毒性的整体评价。本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添

3、加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定参考方法。２术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１希尔函数犺犻犾犾犳狌狀犮狋犻狅狀关于受试物浓度与反应关系的包含４个变量的Ｓ型对数数学模型。Ｔｏｐ－Ｂｏｔｔｏｍ犢＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（ｌｏｇＩＣ－犡）ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ１＋１０５０犢是反应，犡是剂量（或浓度）对数，Ｂｏｔｔｏｍ是最小反应，Ｔｏｐ是最大反应，ｌｏｇＩＣ５０是反应剂量或浓度在最高（Ｔｏｐ）和最低（Ｂｏｔｔｏｍ）中间时的对数，ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ表示曲线的倾斜度。２．２人角质细胞犺狌犿犪狀犽犲狉犪狋犻狀狅犮狔

4、狋犲，犎犓犆角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可合成角蛋白的细胞，体内呈分层生长排列；体外分离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。２．３２０％致死浓度犐犆２０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制２０％的受试物浓度。２．４半数致死浓度犐犆５０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制５０％的受试物浓度。２．５８０％致死浓度犐犆８０在一定条件下使ＨＫＣ细胞生长和活力抑制８０％的受试物浓度。３基本原理本标准采用正常人角质细胞，应用中性红摄取（ＮＲＵ）细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外培养的正常哺乳动

5、物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会干扰细胞的分裂增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红（ＮＲ）是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变，１犛犖／犜２３２８—２００９引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可逆。这些变

6、化导致细胞吸收和连接ＮＲ的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞ＮＲＵ细胞毒性检测程序是基于这一原理设计的一种反映细胞存活／活力变化的检测方法。４试验准备除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂家，如有证据证明，可以使用替代品。４．１人角质细胞人角质细胞可用原代或细胞系：ａ）人永生化角质细胞系ＨａＣａＴ：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）获取；ｂ）正常人角质细胞（

7、ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＮＨＫ）：商品化细胞系，可从美国ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ公司（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣＣ２５０７或ＣＣ２６０７）获取；ｃ）原代人角质细胞（ＰｒｉｍａｒｙＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤，需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。４．２细胞培养基４．２．１人角质细胞无血清基础培养基商品化购置或实验室自行配制，可从美国ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ公司ＫＢＭ（ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ）或ＧＩＢＣＯ公司Ｋ

8、ＳＦＭ（ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳｅｒｕｍＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ）获取。４．２．２人角质细胞培养基补充试剂配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（ＥＧＦ）、胰岛素（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、氢化可的松（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（ＢｏｖｉｎｅＰｉｔｕｉｔａｒｙＥｘｔｒａｃｔ，ＢＰＥ）。配制上述各种成分的贮备液浓度如下：０．１ｎｇ／ｍＬｈＥＧＦ０．５ｍＬ；５．０ｍｇ