芯片重测序检测成骨不全基因突变程序建立及应用

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1、芯片重测序检测成骨不全基因突变程序建立及应用引言据国外流行病学统计，全球范围内成骨不全发病率为1/15000-1/25000[1]。由于地域广阔，人口基数大，目前中国没有相关的流行病学统计报道，但估计会比全球发病率更低[2]。此外，成骨不全还是一种遗传性全身结缔组织疾病，具有遗传异质性，大多数患者以常染色体显性遗传为主，少数为常染色体隐形遗传或者散发突变[3,4]。成骨不全的临床症状比较明显，主要有以下几方面的特征：身体各个部位非常容易发生骨折，而且骨折重复率较高；眼睛内巩膜为蓝色；牙本质发育不全甚至没有发育；听力减弱明显甚至完全消失；脊柱发生前后突出或者侧弯，

2、导致脊柱发生严重变形[5-8]。由于以上症状在临床上的表现又有所不同，根据发病轻重，或者骨折程度，将成骨不全分成几种亚型，比如I型，II型，III型和IV型[9]。近几年又有三种亚型的成骨不全被发现，分别是V型，VI型和VII型[10-12]。成骨不全是单碱基突变引起的遗传性疾病，COL1A1和COL1A2是目前文献报道数量最多的与成骨不全相关的致病基因。迄今为止，在成骨不全患者基因内发现了大约2000个致病碱基突变位点，其中定位于在COL1A1和COL1A2两个基因上的致病碱基超过1600个，大约占总数量的80%-90%[13]。而国内，超过90%的成骨不全患

3、者都是由于COL1A1和COL1A2发生碱基突变所引起的[14]。COL1A1和COL1A2主要编码蛋白质是I型胶原蛋白，这种蛋白在骨骼的生长过程中起到至关重要的作用。当碱基突变后，引起部分氨基酸功能改变，从而导致I型胶原蛋白结构及功能发生变化[15]。引起I型胶原蛋白结构及功能变化时，又有两种突变类型：第一类是COL1A1基因上的点突变导致等位基因在转录合成过程中不能正确识别，引起单倍剂量的不足，因而又引发碱基的移码突变，无义突变等其他类型的突变，导致疾病产生[13,16]。第二类是碱基突变后胶原分子与结构异常合成，并且这些突变是最常见的三股螺旋甘氨酸-X-Y

4、三重域内引起的甘氨酸的置换[16,17]。由于保守的甘氨酸侧链残基能调节胶原内部三股螺旋立体空间构象，而大分子氨基酸无法调节三股螺旋核心结构[18]。因此，带有大量极性或电荷的被替换的氨基酸侧链会扰乱三股螺旋的形成，进而干扰细胞中正常胶原的分泌合成和细胞外胶原纤维的合成。有报道称，在成骨不全人群中三股螺旋甘氨酸突变对骨的发育及骨的生长造成的伤害远超过单倍体剂量不足引起的成骨不全，可以引起更为严重的II型，III型或者IV型[19]。此外，COL1A1和COL1A2基因突变引起的成骨不全是以常染色体显性的方式进行遗传[20]。最近几年，在少数成骨不全患者人群，研究

5、人员发现了其他与成骨不全致病有关的基因，包括CRTAP，LEPRE1，FKBP10，PPIB，SP7，SERPINH1等，这些基因突变引起的成骨不全都是以常染色体隐性的方式遗传[21,22]。其中CRTAP，LEPRE1和FKBP10被报道的次数较多，并且在这三个基因上发现的突变碱基约占突变总数的10%-15%[23-29]。以常染色体隐性遗传的成骨不全患者大多都是西方人，中国甚至亚洲其他地区的人群中发现的数量却很少。2012年，Zhang等[12]在分析一例成骨不全患者序列突变时，在LEPRE1上找到了与成骨不全相关的碱基突变，这是首次在中国人群中找到LEPR

6、E1上的与成骨不全产生相关的突变位点。由于成骨不全在国内的发病率很低，患者人数少，研究人员对于该疾病的了解与认知程度相对较少，在致病基因的研究与分析上还未深入展开，尤其是在致病基因的突变频率、表型与突变之间的相互关系上没有相关的研究报道，远落后于西方国家对成骨不全的研究进展。目前国内对成骨不全的研究与分析主要集中在致病基因突变筛查上，验证国内成骨不全人群中发现的致病基因与国外文献报道是否一致，是否存在地域和种族差异性[30,31]。2005年，秦炜等[30]报道了我国首例成骨不全患者的基因突变结果，通过对OI患者外显子基因测序发现了col1a1基因的第26号内含

7、子5′端剪切位点处GT转变为AT，导致蛋白质功能发生改变。本突变最早是由stover于1993年报道的，在Korkko不同家系的同一位点也发现了相同或不同的突变类型，秦炜等的发现进一步支持了Korkko关于同一突变在不同人群中重复出现的结论[32]。此后国内陆续发现了关于成骨不全致病基因的突变位点，但这仍需要大量的基因学实验来论证这些突变位点是否与成骨不全产生之间存在相关性[33]。..正文1.实验材料1.1.引物稀释、合成主要试剂、耗材及仪器1.1.1试剂Tris-HCIbuffer：购自于美国Sigma公司EDTA：购自于美国Sigma公司1.1

8、.2仪器耗材超净工作台：