dna ladder及提取

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1、DNALadder是一种即用型(readyforuse)DNA分子量标准(DNAMolecularWeightMarker)。包含了1KbDNALadder和100bpDNAladder，可以满足各种常规DNA电泳分析的分子量参照需要。本DNAladder相当于Invitrogen等公司的1KbplusDNAladder，但比Invitrogen公司的1KbplusDNAladder的条带分布更加均匀细致，便于对照DNA分子量。DNAladder中500bp、1000bp和3000bp条带用黑体标记(参见右图)，亮度较高，使辨别条带更加容易。具体每条带的DNA的含量

2、可以参考右图进行计算。本DNAladder中已添加了含有溴酚蓝的DNA上样缓冲液，可以直接使用。每孔上样5微升，即可观察到非常清楚的DNA条带(参见右图)。DNAladder法检测细胞凋亡发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200个碱基或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNAladder）。【材料与试剂】凋亡细胞；蛋白酶K（500μg/ml）8mol/L醋酸钾白细胞裂解液：pH8.0，10mmol/LTris-HCl，10mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA，1%S

3、DS。氯仿无水乙醇，70%乙醇；2%琼脂糖凝胶。【操作步骤】（1）收集凋亡细胞：取1～2×106个细胞，离心后，立即用70％酒精（-20℃）固定2h；（2）洗涤：取出酒精固定的细胞，1000r/min离心5min，去掉上清液，PBS洗二次；（3）裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2小时或过夜；（4）蛋白处理：加75μl8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10分钟后，将上清移至一新的Eppendorf管中；（5）沉淀DNA:加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合

4、，即可见乳白色沉淀，若不明显时可置-20℃过夜，12000r/min离心10分钟，去上清；（6）洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min离心5min，去上清；（7）溶解DNA：根据DAN沉淀的大小，加一定量的蒸馏水或TE，37℃溶解；（8）测定DNA浓度；（9）2%琼脂糖凝胶电泳80V2小时；【结果判断】出现梯状电泳条带，最小的条带为180～200bp，其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带，无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大，迁移距离短，故停留在加样孔附近。细胞凋亡DNALadder检测试剂盒细胞凋亡DNALadd

5、er检测试剂盒一、原理细胞核染色质DNA断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50-300kb的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180-200bp或其整倍数的DNA片段，这些DNA片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带（DNALadder），并据此判断细胞凋亡产生。细胞凋亡DNALadder检测试剂盒提供了一种简便、快速地提取染色质DNA的方法，并增加对小片段DNA的回收，从而增强了检测的敏感性。二、试剂盒组份组份KGA111（20assays）KGA112（50assays）

6、KGA113（100assays）LysisBuffer6mL15mL25mLSolutionA400μL1.0mL2.0mLEnzymeA400μL1.0mL2.0mLEnzymeB400μL1.0mL2.0mLPrecipitant3.0mL6.5mL13.0mLLoadingBuffer80μL0.2mL0.4mL三、操作步骤1．离心收集105~106细胞（1500×g，5min）于1.5mL微量离心管中；2．用PBS洗涤细胞二次（离心1500×g，5min），弃上清；3．沉淀的细胞中加入100μLLysisBuffer，涡旋振荡器上剧烈混合10秒，离心100

7、0×g，5min）移上清于另一1.5mL微量离心管中；4．沉淀再加入100μLLysisBuffer重复上步，合并两次的上清液；5．在上述合并的上清液中加入20μLSolutionA，再加入20μLEnzymeA，55℃反应1小时；6．加入20μLEnzymeB,37℃，1小时；7．加入130μLPrecipitant和950μL冷乙醇,混匀，置—20℃,1小时以上或过夜；8．4℃，12，000-14，000rpm离心15-30min，小心地弃去上清，收集沉淀的DNA；9．加入0.5mL70%的冷乙醇，洗DNA沉淀，再12，000-14，000rpm离心20mi