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1、重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV王清,王锡波,徐龙强,于维林,于红,张文卿【关键词】巨细胞病毒RebinantPP150ofhumancytomegalovirusasantigeneforcolloidalgoldimmunodotassaytodetectHCMVIgMinsera 【Abstract】AIM:Touserebinantpp150ofhumancytomegalovirus(HCMV)incolloidalgoldimmunodotassay(CGIDA)forthedetecti
2、onofHCMVIgMinsera.METHODS:Afragmentofgenecodingforpp150antigenepitopes(840-1048aa)ent(96.0%)egalovirouses,human;genepp150;prokaryoticexpression;goldcolloidal;immunodotassay 【摘要】目的:探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值.方法:PCR扩增HCMVpp150抗原决定簇（840～1048a
3、a）编码基因片段，插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(HCMV)PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术（CGIDA）检测血清中抗HCMVIgM的诊断价值.达载体pMAlp2，转化宿主菌E.coli，诱导表达及纯化.重组抗原CGIDA与酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒对比检测.结果：重组抗原CGIDA与ELISA试剂盒比较,符合率达96.0%；CGIDA检测HCMVIgM的敏感度为74.2%，特异性为100%.结论:重组抗原pp150用于CGIDA对HCMV的早期诊断，具有较好应用价值. 【关键词】巨细胞病毒,人；基因pp
4、150;原核表达；胶体金;免疫斑点法 0引言 胶体金免疫斑点法(colloidalgoldimmunodotassay,CGIDA)快速简便，吕贯廷等〔1〕成功地建立了CGIDA检测HCMVIgG的方法，但国内关于抗人巨细胞病毒(HCMV)IgM的临床检测的报道较少.我们用基因工程方法合成HCMVpp150（841~1084aa）抗原,以胶体金为标记手段,建立了检测血清抗pp150IgM抗体的胶体金免疫斑点法. 1材料和方法 1.1材料 HCMVAD169毒种、宿主菌E.coliDH5α,原核表达质粒pMAlp2为
5、山东省分子病毒学重点实验室提供.EcoRI,HindⅢ,T4DNALigase,iniprepsDNAPrurificationSystems,IPTG,硝酸纤维素膜（孔径0.65μm）等均购自Promega公司.麦芽糖结合蛋白(MBP)纯化树脂购自BioRad公司.抗人IgM及HCMVIgMELISA试剂盒由山东省分子病毒学重点实验室提供.HCMVIgM阳性血清120份经青岛大学医学院附属医院妇产科研究室提供（晶美生物工程有限公司人巨细胞病毒IgMELISA试剂盒检测）;266份临床血清采自青岛大学医学院附属医院正常孕妇.
6、正向引物：5＇TGGCG↓AATTCACCTCTTCCGCTTCTTCGGC3＇，反向引物：5＇GTGTTA↓AGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3＇，PCR产物长度为651bp,产物上游酶切位点为EcoR1，下游酶切位点为HindⅢ. 1.2方法 1.2.1重组pp150抗原的制备HCMVAD169株接种人胚肺二倍体细胞，待细胞出现病变()后，收集细胞，提取总DNA作为模板，通过PCR扩增出HCMVpp150多个强抗原决定簇区目的基因.分别用限制性内切酶EcoRI,HindⅢ酶切上述扩增片段和质粒pMALp2
7、，回收酶切产物和载体片段，然后进行连接反应.将连接产物转化感受态宿主菌E.coliDH5α，挑取经鉴定的单个菌落，37℃培养至A600nm约为0.5.加ITPG分别诱导1,2,3,4,5h后收集菌体，在50mmol／LTrisHCl（pH8.0）溶液中超声波裂解（12s/次，共3次），将沉淀溶于包涵体溶解缓冲液中(8mol／L尿素，100mmol／LNaCl，1mmol／LEDTA，0.1mmol／LPMSF，50mmol／LTrisHCl，pH8．0)，4℃,6000g离心10min，回收上清.每隔1h用复性液(10mmo
8、l／LGSH，2mmol/LGSSG，50mmol／LTrisHCl，pH8．0),将尿素浓度逐步降低到0.5mmol／L，4℃复性过夜，在透析液(50mmol／LTrisHCl，pH8.0)中4℃充分搅拌去除剩余尿素.4℃,6000g离心10min，取上清，复性蛋白1．5mL(0．5g／
