液体配制及实验方法

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1、（一）液体配制1.完全培养基DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液）若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺2.PBS1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO43.胰酶用之前调节PH值至7.64.CaCl2将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液每5ml胶原酶中加入100μlCaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性5.双抗终浓度：青霉素100万U/100ml链霉素100万U/100ml青霉素0.6μg为1个单

2、位链霉素1.2195μg为一个单位称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml6.两性霉素B100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液每100ml完全培养基中加入100μl浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml7.细胞冻存液20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)8STZ溶液STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液

3、.再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕.9油红O原液：油红O0.6g溶于异丙醇（99%）100ml。稀释液：油红O原液20ml，蒸馏水20ml，过滤后使用。10茜素红称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.成骨诱导液配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/LVitC1）β-甘油磷酸钠分子量：216溶于水10mmol/

4、L=216mg/100ml称取216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中2）地塞米松分子量：392.5在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.0.1μmol/L=0.04mg/L将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中制成25000X的浓缩液每100ml低糖完全培养基中加入4μl地塞米松浓缩液3）VitC分子量176.1溶于水称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中8成脂诱导液配方：DMEM(L)+10%FBS+10μmol/L地塞米松+200μmol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1

5、-甲基黄嘌呤（IBMX）+10mg/L胰岛素1）每100ml高糖完全培养基中400μl地塞米松浓缩液2）吲哚美辛分子量：357.79在无水乙醇中的溶解度为1g/50mlPH7.4以下0.2mmol/L=7.16mg/100ml称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇制成200X的浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入500μl吲哚美辛浓缩液3）IBMX分子量：222.25在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml)0.5mmol/L=1.1mg/100ml将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO制成100mg

6、/ml(9100X)浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入11μlIBMX浓缩液4）Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X)每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100μl.溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。（二）细胞培养1.骨髓基质干细胞（BMSC）、脂肪基质干细胞（ADSC）的原代培养1）准备工作所需液体：培养基，血清（FBS），胶原酶消毒（器械、烧杯、滤纸、离心管等）（PBS,枪头，青瓶和塞子，5套器械+3~4个烧杯+滤纸，离心管50+15ml）水浴锅调节温度至37°预热配制BMSC清

7、洗液将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素配制ADSC清洗液由于脂肪组织易污染，故将清洗液装入青瓶中，每100mlPBS加2%双抗和20~40ul两性霉素配制骨髓冲洗液（PBS+3%FBS）即300ul血清BMSC冲洗液及胶原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热2）取组织将SD大鼠（4周60-80g）引颈处死，用75%酒精浸泡5-10分钟取大鼠内脏脂肪，取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染，将取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中取大鼠长骨，尽量将附着的肌肉剔除干净，若骨头断裂髓腔暴露，污染可

8、能性大，弃之。将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次3）收集细胞ADSC:将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎，加入适量II型胶原酶（每1ml脂肪组织加1ml胶原酶）以及CaCl2（200X），将混合物移至15ml离心管中37°C水浴30分钟（每间隔十分钟震荡15秒）,30分钟后将混