220例无精子症及严重少精子症患者遗传学研究

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1、220例无精子症及严重少精子症患者遗传学研究【摘要】目的:检查无精子、严重少精子患者的染色体异常和Y染色体上无精子基因(AZF)微缺失的遗传缺陷。�方法：应用外周血培养和聚合酶链反应（PCR）技术，对220例无精子、严重少精子患者的染色体和11个AZF基因位点进行检查。结果：在140例无精子患者中，发现19例患者染色体异常，异常率为13.57%。有21例患者有AZF基缺失，总缺失率为20.31%，AZFa、AZFb、AZFc缺失率分别为2.38%、4.76%、16.67%。在80例严重少精子患者中，有14例

2、患者有AZF基因缺失，总缺失率为17.50%，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分别为1.25%和17.50%。未发现有染色体异常和AZFa缺失。结论：染色体异常和无精子基因微缺失是导致无精子症、少精子症主要因素，遗传学检查对男性不育患者的病因诊断与治疗有着重要价值。【关键词】不育症；男性；Y染色体；AZF；无精子症；少精子症11已婚育龄夫妇不孕症的发病率高达10%~15%，其中男性不育约占40%，特发性无精子症和严重少精子是男性不育的主要类型。引起无精子或严重少精子的原因极其复杂，遗传缺陷是其中的重要原因

3、之一。男性无精子和严重少精子患者除染色体异常外，Y染色体长臂有控制精子生成的无精子因子（Azoospermiafactor，AZF），这一区域的基因微缺失与无精子和严重少精子密切相关。我们通过对无精子症和严重少精子患者外周血染色体和Y染色体上AZF缺失的检测，探讨了引起无精子和少精子的遗传因素和AZF缺失与表型效应的关系，现报告如下。1材料与方法1.1研究对象来自我院不育门诊就诊的男性不育患者。根据世界卫生组织标准进行精液常规分析、果糖测定、精液脱落细胞学检查等，并排除继发感染、输精管缺如、其它睾丸外伤等病

4、症，经确诊为无精子或严重少精子病例作为研究对象。无精子症140例，严重少精子患者80例。按设计表格逐一填写个人一般状况、个人发育史、生育史、既往病史、体格检查等情况。无精子症和严重少精子病例年龄22~40岁，平均29.03±3.35岁。以我院优生门诊和沈阳市第一医院妇产科有正常生育史患者的丈夫30例为对照组，以10例正常女性为阴性对照组，年龄24~35岁，平均28.12±2.83岁。1.2方法1.2.1精液分析11根据世界卫生组织精液评估标准，每例患者重复两次以上检测，留取标本前应禁欲3~5天。无精子患者，

5、经连续三次精液分析，并经离心沉淀均无精子者确诊为无精子症，并排除继发感染、输精管缺如、其它睾丸外伤等病症。精子密度低于5×106/ml为严重少精子症。1.2.2激素测定采用SEROZYMEI磁分离酶联免疫测试仪（瑞士）测定血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）激素，试剂为SEROZYME专用进口试剂。1.2.3染色体检查采用本室常规外周血染色体检查方法，镜下每例计数30个分裂相，G染色体显带核型分析5个。1.2.4Y染色体上缺失基因检测1.2.4.1无精子基因引物根据文献资料，在Y染色体

6、长臂5~6区30个基因片段位点分别选择了引物AZFa区sY84、sY86，AZFb区sY102、sY134，AZFc区sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中国科学院微生物研究所合成。它们的PCR扩增产物DNA长度分别为326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp和825bp。1.2.4.2PCR反应检测分析1）标本DNA提取：采集患者外周血3ml，肝素抗凝，300011rpm离心20min，取白细胞层加入等量的裂解缓冲液，充分混悬。15000rpm离心3m

7、in，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重复1~2次，常规法提取DNA备用。2）反应条件：25μl反应体系100μl10×缓冲液（10mMTris-HCl，pH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2），8μldNTP混合物（每种核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl），引物浓度按每反应体系50pmol加入超纯水295μl；混合后分装每反应管22μl，加入模板DNA3μl。在PE480PCR扩增仪进行基因扩增。94℃预变性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完

8、成45个循环，最后65℃5min延伸，PCR扩增产物置4℃冰箱中储存。3)产物检测分析：每PCR反应管中加入载样缓冲液3μl，吸取10μl加样,用3%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml，溴化乙啶）电泳，电压8伏/cm，在紫外透射仪下观察结果。2结果2.1染色体分析在140例无精子患者中，发现19例患者染色体异常，异常率为13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq