遵义医学院医学检验系2006级

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1、ELISA竞争法检测伤寒沙门菌O抗体 遵义医学院医学检验系2006级 钱静（0610850107）【摘要】目的采用伤寒沙门氏菌菌体O抗原,建立检测伤寒沙门氏菌O抗体ELISA竞争法。方法采用纯化的伤寒沙门氏菌菌体O抗原,制备伤寒沙门氏菌菌体抗体和酶标抗体，应用直接凝集试验、饱和硫酸铵透析法及ELISA竞争法对制备的多克隆抗体及酶标抗体进行特异性及活性鉴定。结果所制的伤寒沙门氏菌菌体抗原多克隆抗体及酶标抗体与伤寒沙门氏菌菌体抗原发生免疫反应。以伤寒沙门氏菌菌体O抗原作为包被抗原和酶标抗体建立了检测伤寒沙门氏菌O

2、抗体的ELISA竞争法。检测伤寒沙门氏菌O抗体为阳性。结论本方法可用于血清中伤寒沙门氏菌O抗体的检测。【关键词】伤寒沙门氏菌；菌体抗原；酶标抗体；ELISA竞争法；多克隆抗体 伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多[1]。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。近年来，国内外学者开展了对本菌快速检测方法的研究工作，取得了可喜的进展[2]。一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。由于这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快

3、速诊断目的。因此我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，经分离与粗纯化，得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体，建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。结果报道如下： 材料与方法 1．抗体的制备1．1伤寒沙门氏菌O抗原的制备：（通用名为：伤寒、副伤寒及变形菌OX19、OX2、OXK诊断菌液。购于：宁波天润生物药业有限公司。生产批准文号：国药准字S20063048）1．2抗体的制备免疫方法：用伤寒沙门氏菌菌体抗原免疫健康家兔3周，五次免疫剂量分别为1ml、0.5ml

4、、0.5ml、1ml、2ml/只，第一次为背部皮内多点注射，以后为耳缘静脉注射。1．3抗体鉴定直接凝集试验:3周后由已免疫兔的耳缘静脉采血2ml，待凝固、离心、取血清，作20倍稀释，取小试管7支，在每支试管中各加0.5ml生理盐水，再倍比稀释血清。其中第7管不加血清以作为抗原对照，再在各管加入伤寒“O”菌液0.5ml,将稀释血清与伤寒沙门O抗原作试管凝集试验，血清最终稀释度依次为1：80，1：160，……，1:1280，1：2560.摇匀，置37℃水浴2—4小时，放置过夜，次日观察结果。1．4抗体分离与纯化：

5、对已免疫的家兔进行心脏采血50ml,立即注入无菌三角烧瓶中,待血液凝固后分离血清,2000rpm离心10min。取5ml免疫血清加5ml生理盐水，边搅拌边滴加10ml饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20min，吸弃上清，将沉淀溶于适量生理盐水，尽量保持高蛋白浓度，放置于透析袋中，用生理盐水多次更换透析液，即可得伤寒沙门氏菌粗抗体。2．酶标抗体的制备2．1酶标抗体的制备方法:过碘酸钠法①取5mgHRP溶于0.5mlHAC-NaAC缓冲液中，滴入新配制的NaIO4水溶液0.5ml，混匀，4℃

6、30min。②再加入乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min。③然后加入分离纯化的粗抗体水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析过夜，使之结合。④加入NaBH4溶液0.2ml，混匀4℃2h。⑤最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去除上清，以PBS液溶解沉淀并于4℃透析除盐过夜；次日取出离心，去除沉淀，即可得HRP-IgG结合物，以PBS液加至5ml。2．2酶标抗体的鉴定：用双抗体夹心法鉴定。酶标抗体用原倍、1:10倍、1：20、1：

7、30、1：40、1：50、1:100、1：200、1：300倍稀释后进行行鉴定。3．检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法的建立3．1试剂制备与仪器①用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液将伤寒沙门氏菌O抗原稀释40倍为包被应用液；②制备的酶标抗体用PBS-1%BSA稀释10倍为酶标抗体结合物；③显色剂A、B；终止液为2mol的硫酸；④阴性对照血清及待检阳性标本；⑤伤寒、副伤寒及变形菌OX19、OX2、OXK诊断菌液（宁波天润生物药业有限公司。生产批准文号：国药准字S20063048）；⑥已制备的伤寒沙

8、门氏菌O抗体和酶标抗体；⑦PBS-Tween20（酶标用洗涤液）、PBS-1％BSA（酶标用稀释液）；⑧仪器为郑州安图公司anthos2010全自动酶标仪及其控制与分析管理系统。电动恒温水温箱为上海医用恒温设备厂生产。包被用聚苯乙烯酶标板（厂商购买）；加样器全套、试管、洗瓶、吸水纸、水浴箱。3．2操作1包被酶标板　用包被液将伤寒杆菌O抗原稀释40倍加到聚苯乙烯酶标板中，每孔100ul，置水浴箱37℃