液体芯片飞行时间质谱技术在分子诊断研究中的应用

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1、液体芯片飞行时间质谱技术在分子诊断研究中的应用         《生物技术世界》第2007-02期字体大小：　 日期:2007-2-28         文/马庆伟 程肖蕊 博扬生命科技有限公司         分子诊断是遗传学、分子生物学和病理学相结合的产物，它是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。通过对DNA和蛋白质分析来评估个体的生理/病理状态是分子诊断的主要内容。分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、毛

2、发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛固定、石蜡包埋组织中的基因或蛋白。         目前用于分子诊断的技术主要包括基于PCR的方法如PCR-STR、RT-PCR、原位PCR、PCR-RFLP、实时定量PCR等；DNA测序；异源双链分析；化学裂解和酶裂解错配分析；蛋白截断测验；质谱法以及DNA芯片等。这些方法各有其优缺点，如PCR在医学检验学应用最为广泛，但却需要明确被检测病原体、肿瘤和遗传病等基因的序列。又如DNA芯片为快速检测病原体和疾病组织中的突变序列提供了手段，并可实现高通量、大规模的操作，但是其准确性和重复性尚待提高。目前，分子诊断存在的问题，主要集

3、中在准确性、稳定性和复杂性上。液体芯片飞行时间质谱技术（CLINPROTTMMALDI-TOFMS）采用不同功能表面的磁珠（即液体芯片），对复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液进行处理，利用基质辅助激光电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）发现潜在的生物标志物，并能够鉴定单个的生物标志物候选物，具有准确性高、稳定性好、灵敏度高、重复性好、高通量、可自动化等特点，在卵巢癌、肺癌、胃癌、白血病、神经系统疾病等疾病中得到应用，并取得明显的进展。下面就将液体芯片飞行时间质谱技术的原理和工作流程以及在分子诊断中的应用作一简要综述

4、。         液体芯片飞行时间质谱技术概述         液体芯片飞行时间质谱技术的原理         液体芯片飞行时间质谱技术主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。一方面，该技术能够在生物液体中检测指示特异疾病的生物标志物模式或生物标志物谱，另一方面，该技术还可以鉴定单个的生物标志物候选物。液体芯片飞行时间质谱由3部分组成：①磁珠部分即液体芯片部分：目前有疏水作用磁珠、金属螯合磁珠、离子交换磁珠、糖蛋白磁珠和免疫亲和磁珠。②飞行时间质谱仪即芯片阅读仪，用于获取磁珠捕获的蛋白质质量

5、和含量。③分析软件。         液体芯片飞行时间质谱技术的原理是：为解决在不损害功能及不增加背景的条件下分离蛋白质的难题，根据色谱及探针的原理，磁珠（液体芯片）表明经化学（疏水、亲水、阳离子、阴离子及金属离子螯合等）或生物化学（抗体、受体、配体、酶、DNA等）处理，并经过选择性清洗，与加入的能量吸收分子（EAM）结合，形成晶体，样品被送入质谱仪，在特异的激光照射后，带电分子在通过电场时加速，记录仪记录飞行时间的长短，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，蛋白质的质荷比（M/Z）与离子飞行时间的平方成正比。信号由高速的模拟数字转化并

6、记录，被测定的蛋白质以一系列波锋的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图。再采用软件进行质谱图的比对和分析，即可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。         液体芯片飞行时间质谱技术的工作流程         液体芯片飞行时间质谱技术的工作流程因研究的目的不同而不同，通常分为两类：①用于蛋白质/肽表达谱检测研究；②用于发现和鉴定生物标志物的临床蛋白质组表达谱研究。         用于蛋白质/肽表达谱检测研究的工作流程为：①应用磁珠法（MB）和AnchorChipTM技术对血清样品进行质谱检测前的分级分离和制备；②应用基质辅助激光解析电离飞行时

7、间（MALDI-TOF）质谱技术进行检测，得到线性和反射模式的蛋白质表达谱；③应用MALDI-TOF/TOF质谱技术对同一检测样品斑或重新点样以识别低分子量（MW）质谱峰；④应用ClinProToolsTM软件进行数据的筛选，蛋白质组指纹的生成和可视化。该工作流程可用图1表示。         用于发现和鉴定生物标志物的临床蛋白质组表达谱研究的工作流程为：①基于磁珠的样本制备；②MALDI-TOF质谱采集；③数据库检测和生物信息学的比较；④复杂生物标志物模式模型的发现。该工作流程可用图2表示。         分析以上两方面的技术流程可以看到，采用液体芯

8、片飞行时间质谱技术进行蛋白质/肽谱的研究和生物标志物谱发现的研究具有共同的本质，