外周血mscs的分离培养及对gcsf的动员反应论文

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1、外周血MSCs的分离培养及对GCSF的动员反应论文邓均，邹仲敏，张春雷，王军平，艾国平，粟永萍【摘要】目的建立多种种属外周血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（GCSF）的动员反应。方法用percoll（1.131g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养MSCs。以GCSF作为动员剂.freelethodofMSCsfromsomegenusperipheralblood(PB),andexplorethemobilizationresponseofM

2、SCsbyGCSF.MethodsMSCsfromsomegenusPBL)andcarriedoutadherentculture.MSCsderivedbonemarroobilizationbyGCSF.ResultsPBMSCsdifferentgenus.Underourexperimentcondition,rat’sPBMSCscouldbeenisolatedandculturedsteadily.AsignificantlyhighernumberofCFUFofBMder

3、ivedMSCsandPBderivedMSCsthanthatofcontrolgroupaftermobilizationbyGCSF（P＜0.01），almost4foldincrease.ConclusionPBMSCsdifferentgenus,itconcernedallnumberofcirculatingMSCsinBP.derivedMSCs,especiallyPBderivedMSCsbyCFUFassay.Keyesenchymalstemcell;mobiliz

4、ation;GCSF;cellculture正常生理情况下，间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）大量存在于骨髓，循环血液中仅有少量。已有研究证实可从胎儿和新生儿血液中分离培养出循环MSCs［1］。但从成熟个体外周血中分离MSCs，因受实验人员、环境、方法等影响，有成功［2］也有失败的［3］。对不同种属动物(或人)的外周血MSCs进行分离培养，其结果也不一样。粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，GCSF)作为体内重

5、要的调节因子，自GCSF分子克隆和基因合成成功以来，在临床上已广泛应用。而GCSF大量应用于白血病的临床治疗，主要得益于其对造血干细胞的有效动员。那么除了动员造血干细胞外，GCSF能否动员骨髓细胞中的MSCs或其他干细胞，还存在着很大争议［4］。因此，本研究对不同种属的外周血MSCs进行分离培养，在本实验室条件下建立成熟的分离培养外周血MSCs的方法，并探讨GCSF能否有效动员外周血MSCs。1材料与方法1.1实验动物及主要试剂2月龄的健康清洁SD大鼠，体重100～150g，雌雄不拘。健康C5

6、7BL/6小鼠，雌雄不拘，SPF级，6周龄，体重20～25g。健康日本大耳白兔。动物均由本校实验动物中心提供。MEM/F12培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），GCSF（齐鲁制药有限公司）。1.2外周血MSCs的直接分离和培养1.2.1实验标本为了探讨在本实验条件下，能否直接从外周血中分离培养出MSCs，拟对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行MSCs分离培养。标本分别为：①C57BL/6小鼠4只；②SD大鼠4只；③日本大耳白兔外周血4份；④人(志愿者)外周血4份。小鼠和大鼠外周血标本通过剪开的股动

7、脉采集，用肝素化管分别收集0.8mL和5mL外周血；兔外周血标本为股动脉处抽取5mL血液；人外周血标本为肘部静脉抽取5mL血液。1.2.2细胞分离和培养分别将各外周血标本用percoll（1.131g/mL）分离单个核细胞，制成细胞悬液，计数后以6×105/cm2密度接种于培养瓶，置于5%CO2、37℃孵箱。48h后全量换液，去除悬浮细胞，以后3～4d半量换液。细胞达80%～90%融合后，用0.25%胰酶消化传代。1.3GCSF对大鼠MSCs的动员效应1.3.1实验分组2月龄的8只SD大鼠分为2组。

8、正常对照组（BMN表示骨髓源MSCs对照组，PBN表示外周血MSCs对照组）：4只大鼠连续5d尾静脉注射0.9%NaCl0.5mL。GCSF动员组（BMG表示骨髓源MSCs的GCSF动员组，PBG表示外周血MSCs的GCSF动员组）：4只大鼠连续5d尾静脉注射GCSF（20μg·d-1·kg-1）0.5mL。1.3.2外周血和骨髓样本的收集培养对照组和GCSF动a:大鼠外周血MSCs；b:人外周血MSCs图1直接分离、培养外周血MSCs(×10