肾透明细胞癌之alk融合基因表达及功能研究

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1、肾透明细胞癌之ALK融合基因表达及功能研究前言肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于膀胱癌[1]。目前，在全球肿瘤新病例中，肾癌发病率以平均每年2.5%的速度增长，占所有新发肿瘤的2%～3%[2]。每年全球有273,518名肾癌新发病例，并有116,368例患者因该病而死亡。而在中国，每年新发病例有32,508例，死于该病有10,675例[3]。肾癌起源于肾实质中肾小管上皮细胞，又称肾细胞癌。肾细胞癌的病理类型多样，最常见病理类型是肾透明细胞癌，约占肾癌的80%～85%[4]。近年来，影像学的发展给患者带来福音，使得多数肾癌患者在诊断

2、时属于局限性肾癌，手术切除可以治愈大部分早期患者，预后较好，5年生存率Ⅰ期65%～93%、Ⅱ期47%～77%，但是仍有20%～40%的患者手术后出现复发或者远处转移[5]。然而，近三分之一的患者在确诊时已出现远处转移。特别是转移性肾癌的预后相当差，5年生存率不到10%[5,6]。因此，临床上面临的一项重大挑战是晚期转移性肾癌的患者如何寻找新的诊断和治疗方法。随着肾癌发病分子机理阐明和报道，使得在分子水平上针对其发病机制研发新靶点药物成为可能，如抑癌基因VHL在80%的肾透明细胞癌患者中存在失活，从而激活mTOR信号通路，诱导VEGF的表达。因此，

3、针对此信号通路的分子靶向药物成为研究的热点并先后问世：贝伐单抗（bevacizumab），舒尼替尼（sunitinib），索拉非尼（sorafenib），替西莫司（temsirolimus），依维莫司（everolimus），帕唑帕尼（pazopanib）和阿西替尼（axitinib）[7]，已经成为晚期转移性肾癌治疗的一二线药物，虽然在治疗上带来令人鼓舞的成绩，但是达到完全缓解无病生存的患者还是很少。ALK基因编码细胞膜受体蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族。在生理状态下，配体与受体相结合后引起ALK二聚化，继而胞内酪氨酸残基磷酸化，活化下游信号通路

4、[8]。在ALCL中首次发现ALK基因与NPM形成融合基因具有致癌活性[9]。后继研究在IMT、NSCLC和卵巢癌中发现有ALK异位形成新的融合基因[10,11,12]。在NB中也有ALK基因突变的报道[13]。此外，在炎性乳腺癌、食管癌、NB中发现有ALK基因扩增[14,15,16]。PI3K/AKT、RAS/Raf/MEK/ERK和JAK/STAT3等下游信号通路由于ALK基因突变、扩增或者形成新的融合基因异常激活，参与肿瘤的发生发展[17]。2007年，日本学者Soda等首次报道在肺腺癌患者手术标本中发现EML4-ALK融合基因。进一步研究

5、将转染EML4-ALK融合基因的小鼠3T3成纤维细胞接种到裸鼠体内成瘤[11]。其他学者报道EML4-ALK融合基因阳性的人体肺癌组织中ALK基因mRNA水平显著升高[18]。这些研究证实了EML4-ALK融合基因具有致瘤作用，在NSCLC发生发展中起着至关重要的作用。因此，针对ALK的靶向治疗成为肿瘤治疗研究的热点。而在临床上已经报道多例ALK抑制剂用于NSCLC、ACLC、IMT的治疗[19,20]。克唑替尼（Crizotinib）是一种ALK抑制剂，Crizotinib与ATP竞争性结合ALK激酶催化区域起到抑制ALK作用[21]。细胞学实

6、验证实，Crizotinib对ALCL、NSCLC及NB等肿瘤中某些有ALK扩增或易位的细胞株具有抑制作用[22]。2011年8月，由于Crizotinib在临床试验中取得良好的临床疗效，FDA批准Crizotinib用于NSCLC的治疗[23]。目前研究表明，EML4-ALK融合基因的发现和其抑制剂良好的治疗前景为肿瘤患者的靶向治疗开辟了新的道路[24]。第一部分ALK融合基因在肾透明细胞癌中的表达1.实验材料收集25对和62对肾透明细胞癌及其对应的癌旁组织，分别来自解放军总医院和第二军医大学附属长海医院在2011年至2013年期间接受手术切除

7、的肾透明细胞癌。所有标本均获取患者本人书面同意并且本研究通过中国人民解放军总医院和长海医院伦理委员会批准。标本收集严格遵守标本管理相关规定，标本离体后立即切成3小块，其中一块组织放入10%福尔马林固定液中固定。另一小块放入RNAlater中，最后一块放入液氮罐中长期保存。患者临床病理资料见表1.1。1.2实验试剂(1)10%福尔马林固定液（上海亿欣生物科技有限公司）(2)RNAlater（德国Qiagen公司）(3)二甲苯溶液（上海紫一试剂厂）(4)乙醇（台山市众城化工有限公司）(5)30%过氧化氢（江阴市通途商贸有限公司）(6)山羊血清封闭液（

8、北京市中杉金桥生物技术有限公司）(7)EDTA抗原修复液（北京市中杉金桥生物技术有限公司）(8)一抗稀释液（北京市中杉金桥生物技术有限公