基质对土壤酸性磷酸酶活性测定的影响分析,农业基础科学论文

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1、基质对土壤酸性磷酸酶活性测定的影响分析,农业基础科学论文原标题：基于不同方法测定土壤酸性磷酸酶活性的比较　　　　摘要：土壤酸性磷酸酶与有机磷的矿化及植物的磷素营养关系最为密切。目前国内学者在测定酸性磷酸酶活性时主要参照关松荫《土壤酶及其研究法》中以磷酸苯二钠为基质的测定方法，而国外学者主要参照Dick《MethodsofSoilEnzymology》中以对硝基苯磷酸二钠为基质的测定方法（PNPP）。但是，在以磷酸苯二钠为基质测定生成物的过程中，常出现显色程度不明显的问题；另外，采用不同基质测定酸性磷酸酶活性也造成了测定

2、方法选择的困难。为合理选择土壤酸性磷酸酶活性的测定方法，本研究选用酸性、中性和碱性土壤各10个土样，分别采用以磷酸苯二钠为基质，且在显色阶段分别加入pH5.0醋酸盐缓冲液（DPP1）和pH9.4硼酸盐缓冲液（DPP2）的方法，以及PNPP方法测定土壤酸性磷酸酶活性。同时也研究了不同pH缓冲液和苯酚浓度对生成物显色反应的影响。结果表明：以磷酸苯二钠为基质、在显色反应阶段加入pH≤6的缓冲液时，苯酚和2,6-二溴苯醌氯亚胺不显色；当加入pH≥8的缓冲液时，两者之间显色且苯酚浓度和吸光值的Pearson相关系数极

3、显着。这说明pH低是导致高苯酚浓度和2,6-二溴苯醌氯亚胺显色效果差的一个主要原因。此外，采用PNPP方法测定时，在酸性、中性和碱性土壤中，10个样本酸性磷酸酶活性的变异系数分别较DPP2增加了70.04%、42.44%和21.17%;极差分别是DPP2的27.18倍、26.85倍和39.43倍。总之，如果选用磷酸苯二钠为基质测定土壤酸性磷酸酶活性，应在显色阶段加入碱性硼酸盐缓冲液；选用对硝基苯磷酸二钠为基质，是更为简单和灵敏的方法。　　　　关键词：土壤酸性磷酸酶活性磷酸苯二钠对硝基苯磷酸二钠pH显色　　　　土壤磷为植

4、物生长必需的营养元素之一，其中有机磷所占比例达15%~80%[1].由于有机磷不能被植物直接吸收利用，从而成为陆地生态系统一个主要的限制养分[2].磷酸酶可催化磷酸脂或磷酸酐的水解，其活性的高低直接影响有机磷的分解转化及其生物有效性。其中酸性磷酸单酯酶与有机磷的矿化及植物的磷素营养关系最为密切[3-4],且在酸性土壤中占优势[5].　　　　酶的提取比较困难，对磷酸酶活性的测定主要是根据一定量的基质在酶催化反应过程中生成物或剩余底物量间接测得[6-7].自Kroll等最早提出用磷酸苯酯作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性以

5、来[6],对土壤磷酸酶活性测定方法的改进主要围绕基质以及缓冲液的种类进行。已报道采用的基质包括天然的基质（主要是核酸）、β-萘基磷酸钠、β-甘油磷酸盐、磷酸苯二钠、对硝基酚磷酸钠和酚酞磷酸盐等[8-10].由于传统的分光比色测定方法成本低，较荧光比色更具有普遍性。本研究主要关注适用于分光比色的磷酸酶基质。　　　　在分光比色方法中，目前国际上大部分学者使用对硝基苯磷酸二钠为基质测定磷酸酶的活性，且有研究表明该方法是最快速且准确的[9,11].有外文统计，在磷酸酶的动力学特征研究中，有706个数据使用对

6、硝基苯磷酸二钠为基质，而只有140个数据使用其他基质[12].此外，目前我国学者在研究中经常用到的基质是磷酸苯二钠[13].虽早期有研究表明，在pH6.5条件下采用磷酸苯二钠测定磷酸酶活性时存在显色不稳定的问题[11,14],但此测定方法已收录在一些参考书中[15-18].且目前在中国知X上可查阅到不少使用该基质的文献[19-20],在ScienceDirectX也有个别文献[21-22].　　　　由于以磷酸苯二钠为基质测定磷酸酶活性的原理是基于磷酸苯二钠经磷酸酶水解后形成的酚，在碱性条件下与显色剂2,6-二溴苯醌氯亚

7、胺反应，在酚羟基的对位引入醌亚胺生色基而生成兰色的靛酚盐[23-24].目前国内部分参考书在描述土壤酸性磷酸酶活性的测定方法时提到在培养以及显色时均要加入醋酸盐缓冲液，使苯酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺在酸性条件下反应[16-18].但是《MethodsinSoilBiology》中提到培养时加入醋酸盐缓冲液，而显色时加入硼酸盐缓冲液，使最终显色反应在碱性环境中进行[25].国内大部分学者所参考的关松荫的《土壤酶及其研究法》中，在介绍土壤磷酸酶活性的测定方法时，描述为测定酸性磷酸酶活性需采用酸性醋酸盐缓冲液培养，而在显色过

8、程中只提到加入缓冲液，具体是硼酸盐缓冲液还是醋酸盐缓冲液，并未具体说明[15].此外，本文和其他学者前期相关工作表明，在采用磷酸苯二钠为基质加醋酸盐缓冲液显色的过程中出现不显色而影响酶活性测定的现象。故本研究以测定酸性磷酸酶活性时，酸性条件下不利于苯酚与2,6-二溴苯醌氯亚胺显色为假设，选用酸性、中性和碱性土壤来比较基于磷酸苯二钠