1.1植物根系酸性磷酸酶活性测定

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1、植物根系酸性磷酸酶活性测定1.原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即p-NPP）为底物，该底物在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色的对硝基苯酚（即p-NP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性。酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。2.测定方法1）称取（1.2±0.1）g鲜根，加入8mL0.2mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.8），然后进行冰浴研磨，双层纱布过滤，12000

2、r/min离心15min，静置。2）取上清液1mL于15mL离心管中，加入2mL0.05mol/L对硝基苯磷酸二钠（醋酸钠缓冲液配制），摇匀后加盖，于37℃水浴30min。3）水浴后加入2mL0.5mol/LCaCl2及2mL2mol/LNaOH以终止反应，摇匀。4）2500r/min离心5min，取上清液于15mL离心管中，4000r/min下再离心5min。5）取上清液在410nm波长比色，并记录吸光值A410。3.标准曲线的制作1）取13支15mL离心管，按顺序编号，并按表1加入试剂。表1对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号01234560.005μmol/mLp

3、NP（mL）00.010.020.030.040.050.06H2O（mL）0.80.790.780.770.760.750.74pNP含量（μmol）00.000050.00010.000150.00020.000250.0003离心管号7891011120.005μmol/mLpNP（mL）0.070.080.090.100.110.12H2O（mL）0.730.720.710.700.690.68pNP含量（μmol）0.000350.00040.000450.00050.000550.0006摇匀0.2mol/LpH6.5醋酸钠缓冲液80.5mol/LCaC

4、l2（mL）22mol/LNaOH（mL）22）混匀后，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。3）以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R，即对硝基苯酚含量。4.计算方法根系酸性磷酸酶活性是以单位时间内单位重量鲜根或单株根系水解p-NPP生成的对硝基苯酚（p-NP）的量来表示（μg·h-1·g-1鲜根或μg·h-1/株）。即式中：n—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的浓度（μmol）；M—对硝基苯酚的相对分子质量（139.1

5、1g/mol）；t—反应时间（h）；W—样品鲜重（g）。稀释倍数—8a.醋酸盐缓冲液（pH=5.0）A：0.2mol/L醋酸溶液（11.5mL，稀释至1000mL）B：0.2mol/L醋酸钠溶液（16.4gC2H3O2Na或27.2gC2H3O2Na·3H2O定容至1000mL）14.8mlA+35.2mlB混合即得