手足口病预防基因工程重组疫苗概述

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1、手足口病预防基因工程重组疫苗概述第1章绪论1.1手足口病简介手足口病（hand，footandmouthdisease，HFMD）是一种婴幼儿常见的传染病，其主要病原体为肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）及柯萨奇病毒A组16型（CoxsackievirusA16,CVA16），发病后可引起患儿手、足、口腔部位的溃疡或疱疹。部份严重感染者可引发心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎以及中枢神经系统病症在内的等多种疾病[1]。手足口病从最初发现至今已有半个多世纪时间，随着人们对该疾病的研究不断加深，截至目前已发现20余种肠道病毒可

2、引发手足口病。手足口病的主要病原体CVA16病毒于1958年首次在新西兰被发现，之后于1959年提出以手足口病命名该病。1969年，另一主要病原体EV71病毒被首次体外分离。1969后至今，EV71病毒与CVA16病毒交替出现，最终成为手足口病的两大主要病原体[2-4]。世界范围内从上世纪七十年代开始，由EV71病毒及CVA16病毒所引发的手足口病多次暴发[5-7]，其中东南亚地区是手足口病流行范围较广的区域之一，历史上曾有过多次大规模地流行，期间相关病原体EV71病毒及CVA16病毒均有发现并报道。我国自上世纪八十年代初首次发现手足口

3、病后至今，全国十几个省（市）均有相关报道。近年来，手足口病病原体的多样化也使得该病的预防和治疗变得更加困难。目前，我国手足口病的发病人数及死亡人数呈逐年上升的总体趋势。为了更加有效地控制我国境内的手足口病疫情，卫生部于2008年5月将手足口病列为法定报告的丙类传染病，要求各地区及时上报手足口病疫情信息，并加强对手足口病的监测。2008年后，我国手足口病发病数及死亡数在法定报告的丙类传染病中一直处于第一的位置，其发病数所占比例约在30-60%之间且呈现逐步上升的趋势[8]。从发病数及死亡数来看，手足口病在我国所导致的严重程度已经超越了某些

4、乙类传染病。综上所述，加快推动手足口病疫苗的研制对预防该病的流行具有重要意义。..1.2小RNA病毒科病毒VP4蛋白的研究进展小RNA病毒科（Picornaviridae）是（一个由多种正链RNA病毒组成的庞大病毒科）由一个庞大的致病病毒家族所组成，其成员大多可导致人类以及动物发生严重的传染病，例如我们常见的脊髓灰质炎、流感、口蹄疫、甲型肝炎以及手足口病等。它们是迄今为止已发现的动物病毒中个体最小的病毒之一并且其基因组由RNA所组成，其相对分子量约为8.5103KD（30%为病毒RNA的质量）。它们的病毒外壳成20面体结构，外直径约为3

5、0nm左右。小RNA病毒是由60个原体所组成，每一个原体又包括了4个结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3和VP4。在14型鼻病毒中这4个蛋白的相对分子量分别为3.2KD、2.9KD、2.6KD、0.7KD。其中结构蛋白VP4和VP2是由病毒组装后期外壳蛋白VP0切割而成。VP0蛋白成功切割后，病毒RNA基因组进入蛋白外壳内完成后续组装，这样一个完整的病毒颗粒也就随之诞生了。对于结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4在拓扑异构学中的定位关系，科研人员们曾不遗余力的花费了大量精力，在各种实验证据面前其结果逐渐浮出水面。这项庞大的研究中实验

6、人员运用了各种已知的先进手段，其中包括利用化学标记物标记、交联剂、特异性抗体、紫外光照射。最终各国研究人员综合各种证据达成了一致的结论：VP1、VP2、VP3具有8股反向平行β桶状模体结构且处于蛋白外壳的外表面并且是主要的免疫活性区域。VP4蛋白处于蛋白外壳的内部与基因组RNA相连接[58]，由约70个左右的氨基酸组成并且在N端豆蔻酰化[59]。第2章基于HBc和EV71-VP4蛋白的病毒样颗粒制备2.1实验材料及溶液配制2.1.1实验材料1.菌株与质粒：质粒pET-22b（+）购买于Merck-Novagen公司；大肠杆菌D

7、H5α及BL21（DE3）感受态细胞购买于天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物的合成由上海生物工程有限公司完成；基因测序鉴定由Invitrogen公司完成。2.酶、试剂及耗材：限制性内切酶XhoI与NdeI、NEBuffer4、BSA购买于NEarker、DNA琼脂糖凝胶电泳loadingbuffer、PCRAmplificationKit、T4DNAligationbuffer、T4DNA连接酶、DNAFragmentPurificationKitVer.2.0购买于大连宝生物有限公司；TIANprepMiniPlas

8、midKit、考马斯-亮蓝快速染液购买于天根生化科技（北京）有限公司；脱脂奶粉购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；ilipore公司；PVDF膜购于BIORAD公司；金属螯合层析Ni柱购于GEHEALTHCA