动物细胞血涂片的制备

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1、细胞生物学实验动物细胞血涂片的制备、瑞氏染液及细胞观察一、实验目的a)学习涂片制备的一般方法b)学习瑞氏染色的方法c)学习辨认各种血细胞二、实验原理a)血涂片的简介血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极广泛，特别是对于各血液病的诊断具有重要的价值。血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。b)血涂片的制备及瑞氏染液的配制用推片法将血液制成薄的血涂片，使血细胞成单层排列。瑞氏染料

2、是由碱性染料天青（Methvlemblue）和酸性染料伊红（EostmY）合称伊红天青染料即瑞氏（天青－伊红Y）染料。甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。（注：甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。）c)细胞染色的原理细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩。例如：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；

3、细胞核蛋白为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和天青均不易结合，染淡紫色，称为中性物质。d)哺乳动物各类血细胞特点i.红细胞：圆饼状无核，中间薄，周围厚；数量最多。ii.淋巴细胞：基本为圆形，比红细胞稍大；核几乎占据整个细胞，一侧常有小凹陷，染色呈很深的紫色；胞质很少，仅在细胞核外有一薄圈，几乎无色。iii.单核细胞：最大、少、胞体为圆形或椭圆形；胞核形态多样，有卵圆形、肾形、马蹄形等，常偏位，着色比淋巴细胞核浅；核质比小于淋巴细胞。iv.嗜中性粒细胞：基本为圆形，比红细胞和淋巴细胞大，但比单核细胞小；核

4、长，为腊肠状或分叶状（2-5叶），经常很难分辨。v.嗜酸性粒细胞：胞体为圆形，有一个大而染成淡紫色的核；胞质充满粗大的嗜酸性颗粒（红色）；由于核占据了细胞的很大一部分，使颗粒在整个细胞内的分布并不均匀。vi.嗜碱性粒细胞：细胞呈圆形，胞质内有大量小的嗜碱性颗粒，呈蓝5细胞生物学实验紫色，分布于整个细胞，覆盖核。i.血小板：最小，多角形聚集成群。b)牛蛙各类血细胞特点i.红细胞：椭圆形，有核，最大。ii.淋巴细胞：特征同哺乳动物的淋巴细胞，但是为血细胞中最小的一种。iii.单核细胞：细胞形态不规则；核偏位，占整个细胞的1/2-2/3。iv.嗜酸性粒

5、细胞：细胞呈圆形或卵圆形，大小差别比较大，有的比红细胞还大，有的与其他两种粒细胞大小接近；核很大，位于细胞中央或一侧，呈肾形或卵圆形，也有分叶状、环状，染色为淡紫红色；胞浆充满红色圆形颗粒，排列紧密。v.嗜碱性粒细胞：数量极少，细胞为圆形；胞质中充满蓝色或深紫色圆形颗粒，颗粒大小不一，常掩盖核。vi.嗜中性粒细胞：细胞为圆形或卵圆形；核偏位，形状不规则，具有多样性，有肾形、带状、弯月状或分成两叶至多叶，胞核染色为紫红色；胞质着色较浅，其中有淡蓝色颗粒状物质不均匀地分布在胞质内，有时颗粒状物质不十分明显。三、实验材料及试剂a)材料新鲜采集的牛蛙血（

6、采集时加入肝素钠溶液抗凝）。（由老师完成）b)试剂i.肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。（由老师配制）ii.瑞氏染液：瑞氏染料粉末0.1g和甲醇60mL。配法：把染料放在研钵内，加入少量甲醇研磨，使染料溶解，然后把溶解的染料倒入干净的棕色的玻璃瓶当中，并至用完甲醇为止。（由老师配制）iii.pH6.4的PBS：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸二氢钠（无水）0.2g，加入少量蒸馏水溶解并定容至1000mL。（由老师配制）c)用品普通光学显微镜、酒精棉、蜡笔、载玻片等。四、实验步骤流程：清洁－加样－推片－干片－选区－染色－洗片a)清洁载玻片

7、：载玻片在使用之前用酒精棉清洁晾干。b)加样：在干净的载玻片长轴一端离边缘约1cm处的中央用胶头滴管滴1/5滴血。取另一张干净的载玻片作为推片，让推片的一端先出于血滴推片方向的前侧，并与血滴玻片成35～45夹角。c)推片：先将推片向后拉至血滴处，待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上形成一层血膜，即为血涂片d)干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。e)选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血膜，用蜡笔在四周画线（多画几圈），作为提防。f)染色：滴加适量的瑞氏染液覆盖

8、选定区域，染1分钟；在滴加等量5细胞生物学实验的PH6.4的PBS缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面浮现一层金黄色金属物质，然后静置染色15