issr(inter-simple sequence repeat)分子标记的实验原理及操作流程

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1、ISSR（inter-simplesequencerepeat）分子标记的实验原理及操作流程ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在 3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。关键词：标记分子ISSRinter-simplesequencerepeatSSR引物RA

2、PD分子标记单寡聚核酸ISSR标记ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结

3、合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。 一、实验材料　　不同来源的DNA(30-50ng/ul)。 二、实验设备 　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。 三、试剂 　　1、ISSR引物：购买成品或根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。 　　2、Taq酶　　3、10xPCR 缓冲液       4、MgCl2：25mmol/L。 　　5、dNTP：2.5mmol/L。  四、操作步骤：

4、 　　1.在25ul反应体系中，加入 　　　　模板DNA1ul(30-50ng) 　　　　ISSR引物1ul(约5pmol) 　　　　10xPCRBuffer2.5ul 　　　　MgCl22ul 　　　　dNTP2ul 　　　　Taq酶1单位（U） 　　　　加ddH2O至25ul 　　混匀稍离心,加一滴（约20ul）矿物油。 　　2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:94℃1分钟，45℃-68℃40秒，72℃1-2分钟，共40轮循环。 　　3.循环结束后,72℃10分钟，4℃保存。　　4.取PCR产物15

5、ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐，分辨率高）。 　　5.电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。6.用凝胶成像仪观察、拍照。 操作流程简图：注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等    DNA提取可采用CTAB或SDS法    DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录  UBCPrimerSet#9(Microsatellite) 引物名称序列引物名称序列801ATATATATATATATATT851GTGTGTGTGTGTGTGTYG80

6、2ATATATATATATATATG852TCTCTCTCTCTCTCTCRA803ATATATATATATATATC853TCTCTCTCTCTCTCTCRT804TATATATATATATATAA854TCTCTCTCTCTCTCTCRG805TATATATATATATATAC855ACACACACACACACACYT806TATATATATATATATAG856ACACACACACACACACYA807AGAGAGAGAGAGAGAGT857ACACACACACACACACYG808AGAGAGAGAGAG

7、AGAGC858TGTGTGTGTGTGTGTGRT809AGAGAGAGAGAGAGAGG859TGTGTGTGTGTGTGTGRC810GAGAGAGAGAGAGAGAT860TGTGTGTGTGTGTGTGRA811GAGAGAGAGAGAGAGAC861ACCACCACCACCACCACC812GAGAGAGAGAGAGAGAA862AGCAGCAGCAGCAGCAGC813CTCTCTCTCTCTCTCTT863AGTAGTAGTAGTAGTAGT814CTCTCTCTCTCTCTCTA864ATGAT

8、GATGATGATGATG815CTCTCTCTCTCTCTCTG865CCGCCGCCGCCGCCGCCG816CACACACACACACACAT866CTCCTCCTCCTCCTCCTC817CACACACACACACACAA867GGCGGCGGCGGCGGCGGC818CACACACACACACACAG868GAAGAAGAAGAAGAAGAA819GTGTGTG