ho-1对抗汞引起肾细胞凋亡

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1、HO-1对抗汞引起肾细胞凋亡[摘要]目的探讨血红素氧合酶－1(HO－1)对汞引起。肾细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法64只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、单纯染汞组、HO－1诱导组和HO－1抑制组，每组16只。先分别腹腔注射生理盐水、空白液、血晶素、锌原卟啉Ⅸ(znPPⅨ)预处理，8h后处死各组内半数鼠取肾查HO－1表达水平，余鼠除对照组注射生理盐水外，其余3组均腹腔注射HgCl2(2mg・kg-1)，24h后检测血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及肾内总抗氧化能力(TAOC)、丙二醛(MDA)、Bcl－2蛋白表达水平与细胞凋亡指数(AI)。结果　与对照组比较，单纯染汞组T

2、AOC降低而MDA、Cr、BUN、Bcl－2表达水平和AI均明显增加(P＜0.01)，HO－1抑制组除Bcl－2表达受抑外，其余指标的变化与单纯染汞组相似，但更为显著。HO－1诱导组与单纯染汞组及HO－1抑制组比较，TAOC及Bcl・2表达均显著升高，而MDA、Cr、BUN及AI则明显降低(均P＜0.01)。结论HO－1通过抗氧化、上调Bcl－2蛋白表达水平而对抗汞引起的肾细胞凋亡作用。[关键词]血红素氧合酶－1；肾；汞；凋亡；大鼠[中图分类号]R363.2；Q768　[文献标识码]A　[文章编号]1671－7562(2007)04－0287－047氯化汞(HgCl2)是一种肾

3、毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年研究揭示，汞能促进细胞线粒体产生大量H2O2等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在汞所致的急性肾衰中起着重要作用。血红素氧合酶－1(HO－1)是一种抗氧化酶，广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内源性保护物质，但HO－1能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我们应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ(znPPⅨ)分别特异性诱导与抑制HO－1，以探明HO－1对HgCl2引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。1　材料与方法1．1　药品与试剂血晶素、ZnPPⅨ为Sigma公司产品。肌酐(Cr

4、)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TAOC)、兔抗鼠多克隆HO－1IgG抗体及Bcl－2IgG抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋亡检测试剂盒购于Boehringer公司，其它试剂均为分析纯。1．2　动物分组与标本采集选用健康雄性Wistar大鼠64只(体重250－310g)，随机分为4组：对照组、单纯染汞组、HO－1诱导组和HO－1抑制组，每组16只。预先分别给各组大鼠腹腔注射等量生理盐水、空白液(由0.1mmol・L-1NaOH和0.1mmol・7L-1PBS液按体积比1:24配制而成的混合溶

5、液)、溶于空白液中的血晶素(30mg・kg-1)及ZnPPⅨ(20mg・kg-1)，8h后，每组均任挑8只处死，取肾脏，一部分肾置于4％的中性甲醛液中固定作HO－1免疫组化染色，其余部分于－80℃保存待测HO－1活性。余鼠除对照组经腹腔注射等量生理盐水外，其余3组均经腹腔注射HgCl2(2mg・kg-1)溶液，动物自由进食饮水，24h后各组大鼠经2％戌巴比妥钠40mg・kg-1腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测Cr、BUN，然后迅速摘出肾脏，取部分肾组织置于4％的中性甲醛液中固定，剩余肾组织于－80℃保存待测各项生化指标。1．3　免疫组化检测取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包

6、埋切片(厚6μm)，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，于1g・L-1TBS中微波修复抗原10min，再置于3％H2O2中15min，灭活内源性酶，PBS液反复冲洗3次，采用SABC法按试剂盒说明书分别滴加HO－1或Bcl－2抗体(抗体滴度均为1:200)，DAB显色，封片，400倍镜下随机选择5个不重叠视野观察肾小管上皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO－1蛋白表达量采用CD－8病理彩色图像分析系统测定平均光密度值表示，Bcl－2蛋白表达量采用阳性染色指数(PI)表示，PI(％)＝阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100％。1．4　生化指标检测7血Cr、BUN分别采用苦味酸法和

7、二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织TAOC和MDA采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约0.5g，加蔗糖Tris缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，根据HO－1降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁等的方法测定HO－1活性，以1mg蛋白1h催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织HO－1活性(nmol・mg-1・h-1)。1．5　TUNEL法检测细胞凋亡肾组织经4％中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片(厚6μm)，置于包被有多聚