糖尿病大鼠血管钙化的实验研究

《糖尿病大鼠血管钙化的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、糖尿病大鼠血管钙化的实验研究：徐华徐俪源张鸣号李桂忠曹军【摘要】目的观察实验性糖尿病对大鼠血管钙化的影响及其可能机制。方法用肌注维生素D3和灌胃尼古丁建立大鼠血管钙化模型；采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)方法，建立大鼠糖尿病模型。运用VonKossa染色，原子吸收分光光度法测定钙含量，放射免疫分析法测定血浆、血管骨钙素(OC)和肿瘤坏死因子(TNF)含量，以及血浆、血管碱性磷酸酶(ALP)活性。结果钙化组大鼠血管VonKossa染色见平滑肌细胞内和细胞间基质有大量黑色颗粒聚集；与对照组相比，主动脉钙含量、A

2、LP活性、OC含量分别增高1.98、2.83倍和84.12%，主动脉TNF含量明显增加(P均＜0.01)；采用STZ制备糖尿病动物模型，与钙化组相比较，血管组织钙化指标均增高(P均＜0.05)，主动脉TNF含量增高(P＜0.01)。结论STZ制备的糖尿病大鼠模型血管钙化作用可能与促进血浆和血管组织局部的TNF含量增加有关。【关键词】糖尿病大鼠血管钙化肿瘤坏死因子血管钙化是动脉粥样硬化、肾病、衰老、高血压等多种疾病的病理生理基础［1-3］。血管钙化与动脉硬化斑块关系密切，氧化脂类物质和氧化应激引起的慢性炎症对

3、血管钙化的发生、发展可能具有促进作用［4］。糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随着人民生活水平的提高，人口老龄化，生活方式的改变而迅速增加。糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷而引起。糖尿病人群中动脉粥样硬化的患病率较高，发病年龄较轻，病情进展也较快。国外报道在糖尿病病人体内存在冠状动脉钙化、瓣膜钙化以及其他部位的血管钙化，从而导致冠心病等心血管疾病的发生，表明在高糖的环境中可以诱导细胞增殖和骨桥蛋白的表达［5］。但是糖尿病性大血管病变尤其是血管钙化间的关系目前未完全明了，糖尿病时发生血管钙化的

4、确切机制也尚不清楚。本研究在大鼠血管钙化的模型上，观察糖尿病对血管钙化的影响，以探讨糖尿病与血管钙化间的关系及其可能机制。　　1材料与方法　　1.1材料雄性Sprague-Daa公司；维生素D3购自上海通用药材有限公司；大鼠骨钙素、TNF放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。　　1.2实验分组及大鼠模型的制备参照文献［6-7］方法制备大鼠血管钙化和糖尿病模型，取24只雄性SD大鼠(体重180～200g)，随机分为4组，每组6只。①钙

5、化组(VDN)：维生素D3(300000IU/kg)肌肉注射，同时尼古丁(25mg/kg溶于花生油)灌胃，9h后尼古丁重复灌胃1次；②糖尿病组(DM)：将STZ溶解于0.1mol/L、pH4.5、无菌的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，制成浓度为12mg/mL(1.2％)的STZ液，腹腔注射STZ60mg/kg，72h后血糖值≥16.67mmol/L为DM大鼠［8］；③钙化＋糖尿病组(VDN+DM，简称糖尿病干预组)：同时①②操作；④对照组(CON)：操作同①②，肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃，腹腔注射等量的柠

6、檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。　　饲养室内通风良好，室温18～25℃，相对湿度40％～70％，每日12h光照维持，昼夜循环，饲养时间为9～11月份。自由摄食、饮水。定期称重(每3天1次)，钙化处理6周后乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用。摘取全长胸腹主动脉，取5mm升主动脉用10％中性福尔马林固定，用于组织学观察，其余部分作下述测定。　　1.3血管组织总钙含量测定［8］　　取胸主动脉(约10mg)80℃烤干，加入2mol/L硝酸0.5mL，180℃消化并烤干，冷却后加入去

7、离子水(含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧)10mL复溶，取2mL加入1%氯化锶100μL，原子吸收分光光度计(Jena，novAA300)在422.7nm处读取吸光度，测定组织的钙含量(以μmol/g·dg胸主动脉，以等渗PBS制备组织匀浆，4℃8000×g离心10min，吸取上清液，以考马斯亮蓝法行蛋白定量。按照ALP测定试剂盒说明书，采用磷酸苯二钠(金氏)法测定ALP活性(用U/mg·pro表示)。　　1.5血浆及血管组织骨钙素(OC)和肿瘤坏死因子(TNF)浓度测定　　主动脉用PB

8、S匀浆离心后，按照试剂盒说明书，采用放射免疫法测定血浆及主动脉骨钙素的浓度(用ng/g·pro表示)和肿瘤坏死因子浓度(用ng/g·pro表示)。　　1.6VonKossa染色［8］　　血管组织进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，在日光下照射60min，再用2.5%的硫代硫酸钠溶液处理5min，然后依次用碱性品红复染，经脱水、透明、封固，在光镜下观察。　　1.7统计学方法　　数据以均值±标