手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量论文

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1、手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量论文王文娜邓桂凤张玲娣姚彤炜【摘要】采用ChiralpakADH手性柱(250mm×4.6mm，5μm)，建立了正相高效液相色谱(NPHPLC)法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。经优化，以正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，V/V)为流动相，流速0.5mL/min;检测波长261nm。在此条件下，恩替卡韦与光学异构体分离度光学异构体的检出限为0.12mg/L，在0.25～4.0mg/L浓度范围内有良好的线性关系

2、;日内与日间精密度RSD4.0%;按标准加入法计算.freeler在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物，拮抗HBV所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dGTP)，抑制HBVDNA聚合酶和逆转录酶，阻断HBV复制。细胞内作用半衰期为15h，在人体内不被肝细胞代谢，主要从肾脏排出体外。同时，其耐药性好，可有效治疗慢性乙型肝炎，临床应用前景良好4,5。由于手性药物在合成过程中可能引入光学异构体杂质，故采用手性分离方法检查合成产品中光学异构体含量。恩替卡韦及其光学异构体手性分离方法未见报道。本研究采用直接手性HPLC法拆分两光学异构体，建立恩替卡韦中光学异构体杂质限量检查方法。2实

3、验部分2.1仪器、试剂及材料LC10A型高效液相色谱仪、SPD10A型紫外可见光检测器(日本岛津公司);ChiralpakADH手性柱(250mm×4.6mm，5μm，日本Diacel公司)。乙醇(TEDIA)、正己烷(BurdickJackson)及异丙醇(TEDIA)均为色谱纯;三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司);三乙胺(分析纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂);恩替卡韦及其光学异构体(99.87%，浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。2.2色谱条件色谱柱：ChiralpakADH手性柱;流动相：正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05

4、∶0.05，V/V);流速0.5mL/min;检测波长261nm;柱温：室温;灵敏度：0.005AUFS;进样量20μL。2.3溶液制备2.3.1恩替卡韦供试液及自身对照液的制备准确称取适量恩替卡韦于50mL容量瓶中，加乙醇超声溶解，定容，作为储备液(500mg/L)。准确移取储备液2mL于10mL容量瓶中，加正己烷异丙醇(50∶50，V/V)混合溶液(以下简称混合稀释液)定容，得恩替卡韦的供试品溶液(100mg/L)。取适量供试品溶液，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。2.3.2光学异构体对照品溶液的制备准确称取适量异构体于100mL容量瓶中，加乙醇超声溶解，定

5、容，作为异构体的储备液(50mg/L)。准确移取储备液2mL于10mL容量瓶中，加混合稀释液定容，作为异构体的对照品溶液(10mg/L)。2.3.3恩替卡韦与异构体混合溶液的制备取2mL恩替卡韦供试品溶液和4mL异构体的储备液于10mL容量瓶中，加混合稀释液定容，即得浓度各为20mg/L的混合溶液。3结果与讨论3.1不同极性调节剂对保留时间、柱效和分离度的影响由表1可见，当流动相为正己烷和异丙醇时，调节比例，样品和异构体未达基线分离。加入三氟乙酸，保留时间随着三氟乙酸的增加有所减少，仍未达基线分离，但峰型好。加入三乙胺，两者未分开，但能使异构体的保留时间缩短。再改变正己烷和

6、异丙醇比例，两者分离，但是分离度仅为1.18，理论塔表1流动相的优化板数都小于650。在流动相中加入乙醇后发现流动相中的乙醇含量明显影响保留时间、分离效果和理论塔板数。乙醇含量越高，理论板数越大。同时乙醇和异丙醇的比例也明显影响分离效果，乙醇比例增高，分离度和理论板数提高，保留时间也增加。当流动相为正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.1∶0.05，V/V)时，分离效果理想(图2C)。3.2酸碱性对柱效、分离度和保留时间的影响3.2.1三乙胺的影响固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸(70∶12∶18∶0.1,V/V)的比例，改变三乙胺用量，考

7、察三乙胺含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三乙胺含量增加，理论板数和分离度逐渐提高，保留时间稍有缩短。当流动相中三乙胺比例为0.05%和0.1%时，理论板数、分离度和保留时间基本一致。考虑到碱性大对手性柱的损害大，故选择三乙胺用量为0.05%。3.2.2三氟乙酸的影响固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三乙胺(70∶12∶18∶0.05,V/V)的比例，改变三氟乙酸用量，考察三氟乙酸含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三氟乙酸含量的增加，分离度逐渐降低