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1、东方百合tom×亚洲百合quito的ARP—PCR鉴定试验研究2008.3巷iI:jl东方百合tomX亚洲百合quito的ARP—PCR鉴定柴卫淑谭学林(1.山东丝绸纺织职业学院淄博2553OO;2.云南农业大学农学与生物技术学院昆明65O2O1)摘要:以不同杂种系的百合品种进行远缘杂交培育杂种.杂种采用Anchoredrandomprimer—polV—merasechainreaction(ARP—PCR)鉴定.即利用已经在百合染色体上锚定的引物,扩增亲本和杂种的DNA.鉴定杂种.首次报道了利用ARP—PC
2、R技术鉴定百合杂种.实验结果表明:ARp—PcR技术中锚定引物的长度是15bp,退火温度54~(2,只扩增出材料的主带型,可重复性高,可靠性好.关键词:百合:远缘杂交:ARP—PCR1前言百合是单子叶植物纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的总称.百合花型优美,高贵典雅,观赏价值很高,是世界重要的鲜切花品种之一.随着百合类植物在国际花卉贸易份额的不断提高.促进了新品种的选育和推广.种内杂交育种与种问杂交育种是百合育种最重要的途径.可以人为将有利的遗传性状进行自由组合,在田问得到表现后,就可以
3、获得新品种.但是百合杂交常有明显的不亲和性,常使杂种胚早期败育.致使在田问很难得到杂种种子加以繁殖.鉴于育种中杂种胚和胚乳的不亲和导致的杂种胚败育,可采用胚挽救技术来解决.但在培养过程中.外植体携带的母体组织也可能诱导成苗.所以必须进行杂种鉴定.百合育种中常见的杂种鉴定方法有形态鉴定,染色体鉴定,同工酶酶谱分析鉴定和分子标记技术形态鉴定是百合育种中最简单,最经济的杂种鉴定方法,新品种重要的是具有新的花型,花形,花色.杂种幼苗种植到田问,开花时,杂种与父母本的花型,花形,花色相比较即可.如果花型,花形,花色与父母
4、本不同,就可以确定是杂种.但是这种鉴定方法需要的时间长,必须等到百合开花.染色体作为稳定的遗传物质,用于杂种鉴定时不受外界环境的影响.而且操作过程比较简单,在幼苗长根时采样分析.可以在幼苗期确定杂种真实性.但是.如果父母本在田问种植,采样繁琐,而且百合的染色体较大.在压片过程中容易重叠,导致分辨不清.同工酶酶谱分析鉴定在幼苗长出幼叶时进行同工酶的提取,可以在幼苗期鉴定杂种,而且操作过程简单但是同工酶是基因表达后的产物,在植株的不同生长阶段,同工酶的表达也不完全相同.杂种鉴定时,应尽可能在百合生长的同一阶段,同一
5、部位采样.如果父母本生长在田间,杂种幼苗生长在培养基上.同工酶可能有差异.此时采用同工酶做杂种鉴定.结果不可靠.由于在植物生长的不同环境,不同发育阶段,所携带的DNA是稳定的,所以分子标记技术成为杂种鉴定,分析性状连锁的常用技术手段.Abe在研究亚洲百合杂种系花色素苷形成的基因分析中,利用17个l0bp,37个15bp,14个20bp的随机引物,33个ISSR引物,绘制出遗传图谱.这些引物在百合染色体上得到锚定.有确切位点,可以作为百合RAPD分析的基础.本试验通过ARP—PCR鉴定百合远缘杂种苗的真实性,即采
6、用Abe(2002)已经锚定的百合随机引物对杂种及亲本的DNA进行扩增,判断杂种真实性.该方法在国内尚属首次报道,为今后充分利用国内百合资源,培育远缘杂交种,育出我们自己的百合新品种提供技术资料.2材料与方法2.1供试材料通过子房切片培养的方法挽救杂种胚.获得杂种苗.东方百合tomx亚洲百合quito,切片培养8d,1ld萌发的杂种苗.2.2方法2.2.1百合DNA提取参照酚提取法,提取百合DNA.剪1～4g百合的新鲜叶片,在液氮中磨碎.提取DNA混合物后加人RNase,再加人NaAc和乙醇振荡昆匀,析出DNA
7、.加适量TE溶解,保存.对所提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA浓度和质量.2.2.2PCR扩增及电泳检测参照顾红雅.PCR反——47亲业珀煺地应液总体积25ul,1mmol/L引物,0.4mmol/LdNTP,2mmol/LMgC12,1UTaq酶,10~buffer和50ng模板DNA.引物参照Abe等发表序列.TGTCCCAACC—CGGCA,AGCCTGTCGTACGTG.GCAGATGGCACG—GAG,ATAGCGGCGTGCCAG,Taq酶,dNlrP及引物购自上海生工生物工程公司,利用亚洲
8、百合quito和东方百合sobonne对所有引物扩增.PCR扩增仪为PTC一100,反应程序自行设计:93℃预变性3min.然后94℃变性1.5min,54℃退火lmin,72oC延伸2min.40个循环后72oC5min,最后4℃保存.琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物,40V电压1.5小时.紫外灯下照相显示带型3结果与分析经筛选发现引物AGCCTGTCGTACGTG多态性较好,因此用
