搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究论文

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1、搅拌式生物反应器换液培养脐血造血细胞的研究论文.freelbilicalCordBloodHematopoieticCellsinStirredTankBioreactorultipleofcordblood(CB)hematopoieticcellsandtoreachascaleforclinicalapplication，themononuclearcellsfromCBouslydevelopedstirredtankbioreactorultipleoftotalcells，CD34+cells，andprogenitorscells(CFU-GM，BFU-E，CFU-Mix，

2、andCFU-Mk)inbioreactorizedDO.Clinical-scalecultureonesampleofCBinthisbioreactor.TheseresultssuggestedthatthecultureenvironmentinbioreactoralDOandpHcontrollingismorefavorableforstem/progenitorcellmaintenanceandexpansion，andtheexpandedcellsfromonesampleofCBisenoughtotransplantforanadultpatient.Keya

3、topoieticcell；bioreactor；stirredculture脐血细胞中富含造血干细胞，从而成为除骨髓和外周血之外一个重要造血干细胞来源，在临床上有着广泛应用，但脐血中造血干细胞的绝对数量少，无法满足成人的移植要求，而通过体外培养和扩增有望克服这一矛盾。体外扩增骨髓细胞、外周血细胞、脐血细胞的临床实验都已有所报道［1，2］，证明了体外扩增后细胞用于临床的安全性和可行性。目前开发的体外扩增造血干细胞的培养系统主要有平板灌注腔反应器、固定床和流化床反应器、搅拌式反应器等［3］。其中搅拌式生物反应器能提供均一的培养环境，而且取样和数据采集简单，易于实现自动控制，因此，在造血细胞

4、临床规模培养中有较好的应用前景［3，4］。本研究应用自主开发的搅拌式生物反应器系统，进行脐血造血细胞的换液培养研究。材料和方法脐血(CB)和单个核细胞(MNC)的分离脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。供者要求是身体健康、发育良好的非高龄产妇。脐血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养液洗涤2次。培养基和细胞因子体外培养液用IMDM（Gibco公司），使用时添加20％胎牛血清(FBS)，以及SCF（50ng/ml）、IL-3（5ng/ml）、IL-6（20ng/ml）、G-CSF（2.0ng/ml）和GM-CSF（2.0ng/ml），其中SCF、I

5、L-6购于北京宝赛生物技术公司，IL-3购于Pepro-Tech公司，G-CSF购于上海三维制药厂，GM-CSF购于上海海济生物技术有限公司。造血细胞的反应器换液培养将分离得到的脐血单个核细胞以2×106cells/ml的密度在T-175方瓶中培养4天后，再接种到反应器中或T-25型方瓶（Nunc公司）中进行培养，进行的2次实验中接种密度均为0.8×106cells/ml。反应器为自主开发产品，其中反应器中所用材料经过造血细胞的生物相容性检验，反应器工作体积为300-500ml，搅拌系统为磁力搅拌，转速控制为30r/min。反应器的温度控制为37℃，溶氧和pH通过调节空气、氮气、氧气和二

6、氧化碳的流量来控制，通气方式为表面通气。pH控制在7.15，溶氧控制为饱和溶解空气的25％。细胞接种到反应器后，待细胞密度生长至2.0×106cells/ml后进行换液，即取出50％的细胞液，并加入相同体积含有相同细胞因子的新鲜培养液。实验中以T-25方瓶作对照，每瓶装液7ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中进行细胞培养，方瓶与反应器中换液比例和频率相同。细胞计数及活性分析台盼蓝染色后利用血球计数器进行活细胞和总细胞的计数，由于实验中很少能见到被染成蓝色的细胞（死细胞），因此，未进一步计算细胞活性。造血细胞的集落检测集落的检测体系为IMDM培养液，添加20％胎牛血清（FBS）

7、，4mmol/ml谷氨酰胺（Sigma），含0.9％甲基纤维素(4000cp，Sigma)，以及人重组造血生长因子SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、EPO，其浓度分别为50、20、20、20、20ng/ml和2U/ml，并添加1％牛血清白蛋白（BSA）。取(1-3)×104培养或没培养的单个核细胞加入0.5ml集落培养液中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养12天后，进行CFU-GM、BFU-