双光径免疫浊度研究仪测定8型肺炎球菌荚膜多糖

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1、双光径免疫浊度研究仪测定8型肺炎球菌荚膜多糖摘要：［目的］对用双光径免疫浊度分析仪（IMMAGE）定量测定8型肺炎球菌荚膜多糖进行方法学评估，并讨论其检测实用性。［方法］系统研究IMMAGE测定8型肺炎球菌多糖的精密度、灵敏度、回收率、标准曲线的稳定性及干扰因素。［结果］IMMAGE检测8型肺炎多糖的总CV值为2.40%～4.96%，分析灵敏度为0.2μg/mL，稀释样本的平均回收率为99.25％，标准曲线至少可稳定5d，加入不同浓度的19F、5、17F、33F、10A五个血清型的肺炎球菌多糖对检测无

2、显著影响（P>0.05）。［结论］IMMAGE自动化程度高，操作简便，并且检测快速，结果准确，有较高的精密度。对定量测定肺炎8型多糖有较强的特异性。关键词：双光径免疫浊度分析仪；8型肺炎球菌荚膜多糖；定量检测中图分类号：R563.101文献标识码：Ａ1977年美国许可了14价肺炎球菌多糖疫苗和4价流脑疫苗后，这些荚膜多糖的检测标准均为依靠物化和血清学的分析方法分析大量粉剂。随后又发展了一种免疫电泳的方法用来测定肺炎成品疫苗中的多糖含量。经试验发现速率比浊仪（LSR6nephelomety）除了被用于分

3、析抗原抗体之间的动态反应来检测蛋白浓度外，还可用来定量测定多糖。在23价肺炎球菌多糖疫苗成品质控项目中，23型肺炎球菌多糖定量是疫苗的重要检测项目之一。速率散射浊度法（LSR）则是测定各型肺炎多糖含量的主要方法。因为利用了抗原抗体的特异性反应，所以可以准确地检测23价肺炎多糖疫苗中各型多糖的含量。不同于普通化学检测方法无法准确区分各型肺炎球菌多糖，该方法更为精确，并有较高的灵敏度。贝克曼库尔特公司的双光径免疫浊度分析仪（IMMAGE）的工作原理就是基于速率散射浊度法。为此，我们对用IMMAGE测定8型

4、肺炎球菌荚膜多糖进行了系统的评估，并讨论其检测实用性。1材料与方法1.1肺炎球菌多糖8、19F、5、17F、33F、10A六个型别的肺炎球菌精制多糖。1.2血清8型肺炎血清来源于丹麦国立血清研究所。1.3相对标准品各项生化检测指标均合格的肺炎精制多糖，经冻干衡重，精确标定后，保存备用。1.4仪器6贝克曼库尔特公司生产的双光径免疫浊度分析仪（IMMAGE），UDR试剂盒以及配套的缓冲液buffer1、稀释液dilution1，由贝克曼库尔特公司提供。1.5方法先将相对标准品放入IMMAGE的样品盘中，将

5、血清倒入试剂盒放入试剂盘中，进入IMMAGE的用户自定义试剂（UDR）系统，使用自建的用户自定义检测项目，进行定标，建立标准曲线。然后将检测样品放入样品盘中，用自定义检测项目测定样品。仪器可通过多点定标曲线自动计算样本中的多糖含量。1.6统计学处理采用MicrosoftExcel2003和SPSS统计软件处理检测数据。测定结果以x±s表示，两样本均数用t检验。2结果2.1重复性测定用8型肺炎球菌血清分别测定标示量分别为2.0、1.5、1.0的A、B、C3个8型肺炎多糖样品各10次，结果见表1。2.2回

6、收率测定用8型肺炎球菌血清重复测定8型肺炎多糖样品10次,回收率为(99.25±0.02)%(表2)。2.3灵敏度用零浓度的空白液连续检测10次。测定结果为（0.120±0.016）μg/mL,计算分析灵敏度为0.26μg/mL(表3)。2.4稀释实验将样品分别稀释15、20、30、40倍，重复检测3次，回收率�为96.40％～104.35％，平均值为99.82％。回归方程为:Y=28.759X+0.0369，r=0.998（表4）。2.5标准曲线的稳定性用相对标准品配制3个浓度的标准校准物，将标准校

7、准物作为样品检测，每天测定1次，每次双份测定，连续5d。经t检验，校准物的测定结果与定值比较,差异无统计学意义（�P>0.05），标准曲线至少可稳定5d。2.6干扰实验采用配对差异试验法，建立8型肺炎球菌多糖样品对照组和加入3个浓度的干扰物的试验组，每组样品同时测定3次。计算干扰百分率（P）。干扰物为8、19F、5、17F、33F、10A六个血清型的肺炎球菌多糖。检测结果干扰百分率（P）为1.35%～�2.37%，配对t检验分析加入干扰物前后的肺炎8型多糖测定结果表明，8型肺炎球菌多糖样品中加入8、1

8、9F、5、17F、33F、10A六个型别的肺炎多糖及浓度对IMMAGE测定8型肺炎球菌多糖无明显干扰（P>0.05）。3讨论623价肺炎球菌多糖疫苗含有1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F共23个血清型的肺炎球菌多糖。疫苗中各型肺炎多糖含量是一个重要的质量指标。目前速率散射浊度法（LSR）是定量测定多价肺炎球菌多糖疫苗的重要方法之一。该方法是建立