犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养后细胞表型变化论文

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1、犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养后细胞表型变化论文欧阳辉，刘维永，卫向阳，顾春虎，宿学家，郑奇军，刘兴光【关键词】,间质干细胞Primarystudyofcellphenotypeofisolatedandculturedcaninebonemarroesenchymalstemcellsinvitro【Abstract】AIM:Toobservethephenotypechangesandbiologicalcharacteristicsofnaturallydifferentiatedcaninebonemarroesenchymal

2、stemcells(BMSCs)anddifferentiatedafterinducedthecaninesbonemarroplification,thegroorphologyicroscopeandsomeantigensinedbyimmunohistochemistrystain.RESULTS:SH2,Vimentin,αSMA,collagenⅠandⅢinindisplayednegativereaction.Theinducedanddifferentiatedcellsshoininn［(50.2±2.5)%］.Th

3、epositiveexpressionofαSMAdecreasedto(42.3±1.6)%andthatofvimentinincreasedto(86.2±2.4)%.CONCLUSION:Thephenotypesandbiologicalcharacteristicsofnaturallydifferentiatedmyofibroblastoreactivethanthoseoffibroblastsandmoresuitabletobeusedasseedcellsinconstructingtissueengineerin

4、gheartvalve(TEHV).【Keyesenchymalstemcells;bonemarromunohistochemistry;canine【摘要】目的：观察犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）经分离、自然扩增及诱导分化后表型变化和生物学特性.方法：利用骨髓穿刺、percoll密度梯度法离心分离继而贴壁筛选纯化BMSCs进行接种培养，体外扩增；倒置显微镜下观察其形态学变化.freelentin,.freelinin的表达均为阴性.在加入bFGF等诱导培养基作用下，可以诱导分化出成纤维细胞，其诱导分化率为(50.2±2.5)%.诱导

5、后αSMA表达阳性率下降为(42.3±1.6)%，vimentin表达阳性率上升为（86.2±2.4）%，生长扩增能力强，2o龄，由第四军医大学动物实验中心提供；DMEMLG(DulbeccoEaglesminimumessentialmedium，改良Eagles培养液，低糖型）培养基，新生牛血清（FBS），胰蛋白酶(美国，Gibco公司)；MCDB201培养基，细胞培养专用青、链霉素、两性霉素B混合液，MTT［3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltertrazoliumbromide四唑盐］(美国，S

6、igma公司)；percoll分离液(含乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒1.073kg/L，美国，Pharmecia公司)；DMSO(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜，美国，Amresco公司)；SH2mAb(Srchomology2，美国，BD公司)；Ⅰ,Ⅲ型胶原mAb(NIDCR惠赠,美国)；Vimentin,αSMA,CD34,Ⅷ因子,LamininmAb，PBS(phosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液)，PV9000二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京，中山生物技术有限公司)；倒置相差显微镜(德

7、国，Leica公司)；CO2细胞培养箱(HERAcell，德国，Heraeus公司)；酶联免疫检测仪(美国，μQuant公司)；图像分析：LeicaQ570c真彩色图像分析系统(德国，Leica公司)，数码摄像机(JVCky30FBCCD,日本，JVC公司).1.2方法1.2.1细胞原代培养与传代无菌条件下通过犬双侧股骨大转子穿刺获取骨髓原液10~15mL/犬，重悬于20mLDMEMLG(含青霉素105u/L，链霉素100mg/L，两性霉素B的混合液25μg/L)，以900g离心10min，弃上清，DMEMLG重悬至6mL/管，混匀；另取

8、10mL离心管，预加3mLpercoll液，将两者缓慢叠加，以900g离心30min；取交界白膜层，加DMEMLG洗涤2次；再以含100mL/LFBS，青、链霉素、两性霉素B混合液的DMEML