美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性分析论文

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1、美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性分析论文张成桂，何正春，焦春香，刘光明【摘要】目的研究从美洲大蠊中提取的抗癌活性成分的体外抗氧化活性，并对其组成进行了初步分析。方法采用体外化学模拟体系研究了美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性，经过SDS-PAGE分析和采用Folin-酚法测定对抗癌活性成分的组成进行初步分析。结果美洲大蠊中抗癌活性成分在清除二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）和·OH自由基的效果和总还原能力均表现出不同程度的量效依赖关系；清除DPPH·自由基能力的EC50值为0.309mg/ml；清除·OH自由基的EC50值为8.776mg/ml；抗癌活性成分还原力的

2、EC50为1.103mg/ml；经过SDS-PAGE分析呈现的抗癌活性成分组成主要由一系列小分子多肽组成的混合物，小分子多肽在抗癌活性成分中的含量为62.7%。结论美洲大蠊中抗癌活性成分具有抗氧化活性，其活性弱于Vc.freelericanaL.抗癌活性成分由大理学院药学院昆虫药物研究实验室提供，由蜚蠊科虫体鲜品或干品经醇水提取、大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱精制而成［申请(专利)号：200810059054.X］，保存于4℃冰箱中备用。1.2试剂、药品和仪器无水乙醇、H2O2、硫酸亚铁、水杨酸、冰乙酸、亚油酸、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、HCl、

3、DPPH(2,2-二苯基-1-苦基苯肼)、Vc、等均为分析纯。Ultra-spec2100紫外可见分光光度计(AmershamBiosciences)、超声波破碎仪(SONISS公司)、RE-52CS1旋转蒸发器(上海亚荣)等。2方法2.1抗氧化活性分析2.1.1清除DPPH·活性的测定清除DPPH·活性的测定参照Kim等［4］的方法：二苯基苦味肼基自由基(DPPH·)是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。DPPH乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。在DPPH乙醇溶液中加入抗氧化剂后，抗氧化剂可以与DPPH·结合或发生替代，使DPPH·数

4、量减少，溶液颜色变浅，在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。因此，可以在517nm波长处检测抗氧化剂对DPPH·自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。首先配制0.2mmol·L-1无水乙醇溶液的DPPH：准确称取4.4mgDPPH粉末，用无水乙醇溶解并定容于50ml容量瓶中，摇匀，该试剂现配现用。取不同浓度的样品溶液各4ml，再加0.2mmol·L-1DPPH2ml溶液。室温黑暗放置30min后，用相应的溶剂做参比，在517nm可见光波长测定吸光值分别为A空白和A样品。根据公式计算样品清除率I(%)=(A空白-A样品)/A空白×100%；Acontrol=2

5、mlDPPH溶液+4ml无水乙醇的吸光度；Asample=4ml样品溶液+2mlDPPH溶液的吸光度；Ablank=4ml样品溶液+2ml无水乙醇的吸光度。以维生素C作对照比较。抗癌活性成分在自由基清除率为50%时所消耗的剂量，可以用内插法在相应的清除率和浓度的曲线上将相应的值计算出来，计算所得即为EC50。2.1.2对·OH自由基的清除率测定清除羟基自由基的测定参照文献［5］的方法。利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。该产物在510nm处有强吸收，若在此反应体

6、系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少。以2.0mmol·L-1FeSO4∶1.0mmol·L-1H2O2∶6.0mmol·L-1水杨酸=1∶1∶1的比例依次加入到烧杯中，振荡摇匀，配制300ml。于37℃水浴温浴15min。取10ml试管，每支都加入上述5.0ml溶液，然后分别加入含不同浓度的样品溶液1.0ml，摇匀，继续于37℃水浴加热15min，待加热完毕后以超纯水调零，应用紫外分光光度计于510nm处测定吸光度Ai,不加样品只加超纯水的试管检测吸光度值为A0。以维生素C作对照比较。根据下式计算抗癌活性肽成分对·OH

7、的清除率：·OH清除率(%)＝(A0-Ai)/A0×100。清除·OH自由基的EC50值的计算同上。2.1.3还原能力的测定还原能力的测定参照文献［6］的方法。取不同浓度的样品溶液各2.5ml，再分别加入2.5ml的0.2mol·L-1，pH6.6的磷酸盐缓冲液和2.5ml1%的K3Fe()6溶液，混匀后于50℃保温20min后再加入2.5ml10%的三氯乙酸溶液，混合后以3000r·min-1离心10min。取上清液5ml，加5ml蒸馏水和lml0.1%的FeCl3，混合均匀，10min后测定700nm处的吸光度，以80%甲醇为参比。吸光值越大表示