葛根芩连汤上清液与沉淀中异黄酮类成分指纹图谱的研究论文

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1、葛根芩连汤上清液与沉淀中异黄酮类成分指纹图谱的研究论文谭晓梅闫琰罗佳波张玮【关键词】葛根芩连汤；,,指纹图谱；,,上清液；,,沉淀摘要：目的通过应用三维高效液相色谱，建立葛根芩连汤上清液和沉淀中异黄酮指纹图谱的方法，明确其上清液和沉淀中异黄酮类成分的异同，以便进一步探讨该方的配伍规律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成对照品溶液，葛根药材水煎液、葛根芩连汤上清液、沉淀用二甲基亚砜溶解制成供试品溶液，采用三维高效液相谱对葛根芩连制剂进行指纹图谱实验研究，流动相为甲醇水乙腈梯度洗脱，扫描波长为200～400nm。结果在梯度洗脱条件下.freell,先煎葛根20min,.freelin

2、,煎两次,趁热120目滤布滤过,合并滤液。90℃定容至1000ml,静置室温后，于冰箱4℃内静置24h，取出，离心以3000r/min，得到上清液，定容到1000ml，为供试品溶液1；沉淀于烘箱内50℃干燥24h后，加适量二甲基亚砜使溶解，定容到1000ml，过滤，得供试品溶液2。2.2色谱条件甲醇∶水∶乙腈梯度洗脱［4，5］检测波长的选择。结果见表1。依据DAD检测的三维图谱,选择可将全谱物质均能检测到的250nm作为最后的检测波长(图1～3)。表1梯度洗脱条件（略）图1葛根药材水煎液（略）图2葛根全方上清液（略）图3葛根芩连全方沉淀（略）2.3对照溶液的制备2.3.1对照药材

3、溶液的制备取葛根药材15.09g，水煎煮2次，煎煮时间分别为30，20min，滤过，煎煮液定容到1000ml，即得。2.3.2对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷元各5mg，于50ml容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得。2.4样品测定精密吸取各溶液10μl，注入高效液相色谱仪（HPLC）中，参照高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行实验，以对照药材为参照色谱，测定并记录色谱图，以中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版采用多点校正的方法进行计算分析。2.5对照实验吸取对照品溶液10μl，注入HPLC，得知21.5min左右的峰为葛根素，40min左右为大豆苷元。2.6精密

4、度实验取对照药材溶液连续进样6次，测得峰共有15个，其中6个共有峰相对保留时间RSD小于1%，其共有峰的峰面积占总峰面积的78%～83%，各谱图相似度为0.999。结果见图4。图4对照药材指纹色谱图（略）2.7重复性实验平行做6份汤剂，同供试品1的制备方法，测定，测得峰共有18个，其中6个主要峰保留时间RSD小于1%，共有峰占总峰面积的56%～62%，各谱图相似度为0.992～0.995，表明其重复性实验较好。结果见图5。图5葛根芩连汤上清液重复性考察指纹色谱图（略）2.8稳定性实验取供试品溶液1，分别在0，2，4，6，8，12，24h，测得其中6个主要峰保留时间RSD小于2%，

5、共有峰占总峰面积的55%～67%，各共有各谱图相似度为0.989～0.997，表明样品溶液在24h内稳定。结果见图6。图6葛根芩连汤上清液稳定性考察指纹色谱图（略）3结果葛根药材水煎液中在250nm左右有最大吸收的物质有6种，其紫外吸收行为如图1，指纹图谱见图7，葛根芩连全方水煎液的上清液中最大吸收为250nm的主要吸收峰的紫外吸收行为见图1，指纹图谱见图8，葛根芩连全方沉淀中最大吸收在250nm附近的主要吸收峰，其紫外吸收行为见图3，沉淀的指纹图谱见图9。图7葛根药材水煎指纹图谱（略）图8葛根全方上清液指纹图谱（略）图9葛根芩连全方沉淀指纹图谱（略）4讨论由图7～9指纹图谱可以

6、看出，葛根芩连全方上清液与葛根水煎药材均具有特征性色谱1～6号峰，而葛根芩连全方沉淀中仅有3～6号峰，上清液中1号峰、2号峰、5号峰在所有峰中所占组分较药材中高（以葛根素为1计），4号峰较药材中低，6号峰两者含量相当。从总体上讲，上清液与沉淀中葛根素含量之和与药材单煎的含量相当。沉淀产生的原因可能是由于黄连中生物碱类成分为碱性，而葛根中的异黄酮类成分呈酸性，全方煎液为酸性，可能由于煎煮过程中pH值的改变而产生沉淀。黄连中的小檗碱、巴马丁、药根碱、黄连碱均为季铵碱，其结构中的氮原子以离子状态存在，同时含有以负离子形式存在的羟基，而葛根中的葛根素具有7位酚羟基，大豆苷元具有4'位酚羟

7、基［6］，可能与氮离子络合形成络合物。本实验结果表明，配伍后葛根也与方剂中其他药物发生沉淀反应，产生的沉淀中存在异黄酮类成分，但含量较低，可能是因为全方制剂中含有黄芩黄酮类、甘草酸类成分，三者存在竞争机制，其具体机制有待于进一步探讨，在制备成方制剂的过程中，不能够简单将沉淀抛弃处理。