水稻苗期白化致死突变基因asl4的图位克隆与功能初步分析

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1、水稻苗期白化致死突变基因asl4的图位克隆与功能初步分析第1章文献综述1.1引言光合作用是影响水稻产量的关键因素之一，而叶片是进行光合作用的重要器官，叶色在很大程度上决定了光合作用的效率。叶绿素作为高等植物进行光和作用的重要物质之一，功能是捕获光能并转化为化学能。植物的叶片呈现的颜色是由其中含有的各种色素所决定的，由于绿色的叶绿素占优势，所以正常的叶片通常表现为绿色，正常的水稻绿色叶片中叶绿素a和叶绿素b的比例约为3：1[2]。光合作用正是在光合色素的参与下，吸收光能，把二氧化碳和水转化为供植物

2、生命活动需要的碳水化合物的过程。据统计，水稻植株中90％～95％的碳水物质来自于植物叶片的光合作用。因此光合作用的速率与植物中叶绿素的含量以及叶绿体结构与功能有着密切的关系，已有研究表明水稻的净光合速率与叶绿素含量是正相关的[3]。在植物的生命活动中，叶绿体除了参与光合作用外，还参与其它必需的植物功能，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸和油脂、植物激素、维生素以及次生代谢物的合成[4]。叶绿体是半自主性细胞器，由前质体发育而来，其正常发育需要核基因和叶绿体基因的相互协调。自然或非自然因素都会导致与叶绿素合

3、成或叶绿体发育相关的基因发生突变，造成叶绿素合成或降解受阻，叶绿体发育缺陷，最终引起叶色的突变。1.2叶绿素与叶绿体叶绿素是二氢卟吩色素，由原卟啉Ⅸ通过生物合成而形成的，结构上和卟啉色素如含铁的血红素类似，在二氢卟吩环的中央有一个镁原子(图1-1)。高等植物中最主要的是叶绿素a和叶绿素b，两者结构的不同是在叶绿素a的II环位置3上是1个甲基，而叶绿素b在同样的位置上有1个醛基。叶绿素在光合作用过程中起着光吸收、能量转换和电子转移的作用[5]。叶绿素的生物合成途径比较复杂，相关基因之间互相调控，构

4、成一个复杂的合成调控网络。从谷氨酰-tRNA（Glu-tRNA）开始到Chlb合成结束为止一共有16步，共有20多个基因编码的16种酶参与完成[6]。叶绿素的合成途径中任何一个环节出现异常都可能会影响Chl的合成,从而引起植物叶色突变。目前通过对光合细菌的分子调控机制研究，将高等植物光合作用的大部分基因已经鉴定出[7]。下图(图1-2)显示了在被子植物中叶绿素合成过程[8]。在高等植物的叶肉细胞中一般含50～200个叶绿体，约占细胞质的40%，因物种细胞类型，生态环境，生理状态的差异叶绿体的数目

5、也有所不同。叶绿体由叶绿体外被(chloroplastenvelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)构成，叶绿体含有3种不同的膜：外膜、内膜、类囊体膜以及3种彼此分开的腔：膜间隙、基质和类囊体腔[9]。叶绿体是半自主性细胞器，与光合作用有关的酶分布在基粒和基质中。当叶绿体结构发生异常时，其光合色素的含量和组成也会出现异常，导致植物光合能力降低甚至失去光合能力进而出现死亡现象。因此，叶绿体的发育异常会导致植物光合作用发生障碍，进而影响植物生命活动的正常进行。下图是叶绿体的显

6、微结构(如图1-3)。..第2章材料与方法2.1试验材料本试验中用到的水稻苗期白化致死突变体asl4是用60Coγ射线照射粳稻嘉花1号诱变而得到的，取其M2代杂合子与籼稻广占63S杂交获得F1代，将F1代自交得到的F2代分离群体用于遗传分析与基因定位。由于突变体在苗期是致死的,因此我们采用杂合体来保存突变性状，经过在上海、海南两地多代的连续自交,表现出稳定遗传的特性。.2.2试验方法2.2.1突变体的表型观察为了明确asl4植株的突变表型，取突变体asl4和野生型嘉花1号的种子，将其

7、在25℃条件下浸种催芽4d，然后将发芽后的种子播种在水稻土里，放置在32℃、光照强度为180μmol/（m2.s）的光照培养箱（GXZ智能型，宁波江南仪器厂），每天光照12h，以及自然条件下进行培养，观察突变体及其野生型嘉花1号的叶色变化情况。2.2.2突变体光合色素含量的测定收集在32℃条件下生长至三叶期的野生型嘉花1号及突变体asl4植株的第三片叶，分别称取0.02g，剪碎之后放入具塞试管中，然后加混合提取液5mL(乙醇∶丙酮∶水=5∶4∶1)，在常温的条件下避光浸泡18h，直到叶色褪

8、白为止，使用分光光度计（BECKMANCOULTER-DU720）分别测定在470nm、645nm和663nm波长下上清液的吸光值，各数据重复测量3次取平均值。然后根据公式分别计算野生型嘉花1号及突变体asl4叶片中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量[74]我们用杂合基因型单株（ASL4/asl4）与广占63S杂交后得到F1代，F1自交繁殖后获得F2代种子，然后在相同条件的培养箱内分株系种植F2代，大约有1/2的株系可以分离出白化突变体，观察并统计可分离株系的叶色分离情况，分析突变体的遗传方