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1、实时荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的应用研究与展望李荣德董芙蓉范祥云徐恺邱杰徐扬黄丽芬 摘要实时荧光定量PCR技术实现了对低拷贝基因表达量的快速、准确定量,综述了目前水稻氮素吸收利用相关基因的研究成果,展望了荧光定量PCR技术在水稻氮素相关基因表达中的应用前景。 关键词水稻;氮素;基因表达;荧光定量PCR;应用研究;展望 20世纪60~70年代水稻矮化育种和杂交稻三系配套的成功和应用使水稻产量大幅度提高,但同时导致氮肥施用量的急剧增加。尽管氮肥在提高水稻产量的过程中起着非常重要的作用,但对地下水、土壤、河流、湖泊和大气等农业环境的污染严重,间接影响人体健
2、康。目前在作物生产中氮素利用率较低,只有28%～40%[1],而水稻是我国第一大粮食作物,因此如何提高水稻氮素利用率,是当前亟需攻克的重要课题。笔者介绍荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的研究应用,以期在基因水平上为水稻育种提供一种方法。 1水稻与氮素的关系研究 1.1氮在水稻生产中的作用 世界上许多地区的水稻生产越来越注重于优化籽粒产量、降低生产成本、减少对环境的污染危害[2]。限制水稻生产的投入之一是氮,氮素对水稻是重要的,约75%的叶片氮与叶绿体有关,而后者通过光合作用在干物质生产中发挥着重要的生理作用。在营养生长期水稻吸收氮素促进生长和分蘖,从而
3、决定潜在的穗数;在穗形成初期氮素有利于小穗的形成;而在穗形成后期,则通过减少退化小穗数增加谷壳大小而增加库容。氮素在抽穗前增加了茎和叶鞘中碳水化合物的积累,而在籽粒灌浆中则有助于增加籽粒中碳水化合物的积累。 1.2水稻氮肥吸收利用率现状 长期以来大量施用氮肥一直是稳定和提高水稻产量的重要措施,因不断增加水稻植株中的氮素含量导致回报率降低,并不是总能增加水稻产量,因此从经济方面考虑这一措施并不总是最优的。同时,过量施用氮肥还会对环境和人体健康产生潜在的不利影响,并增加病害的发生和倒伏。水稻的种植容易导致氨挥发、硝化-反硝化脱氮、淋溶以及径流而使氮素丢失。基于此,国内
4、外越来越重视研究和改良水稻氮素吸收利用的遗传潜力和生理机制,建立高效生产技术体系,从根本上提高水稻对氮素营养的吸收利用。我国的氮肥吸收利用率为30%～35%,低于世界平均水平。我国与日本的水稻单产水平大致相当,但单位施氮的产谷效益不足日本的1/2。根据李荣刚报道,江苏省水稻的氮肥吸收利用率仅为19.9%,显著低于全国平均水平,如此低的氮肥吸收利用率主要是由于江苏稻农氮肥施用量过高所致。 1.3水稻氮素利用效率与高氮素利用水稻品种 提高水稻养分利用效率尤其是氮素利用效率的研究正在全球兴起。水稻利用氮素的效率包括氮吸收效率和氮利用效率。植物氮吸收量与供氮量之比为氮吸收
5、效率;而籽粒产量与氮吸收之比为氮素利用效率。近些年开始强调氮高效水稻育种,并不是对水稻育种40余年所取得的育种成果的否定,而是在节约资源和保护环境背景下对水稻育种工作提出的新的要求;并不是一味追求氮素利用效率而牺牲对高产要求,而是较高的产量水平下的高氮素利用效率。在现有的推广品种中就存在产量高、氮素利用效率高的“双高”基因型的品种。 2水稻氮素吸收利用的相关基因 植物氮素营养作用是一个非常复杂的过程,氮效率的遗传力、控制基因的数目、基因间的相互作用等问题仍不十分明确,如何选择氮素高效率基因型一直是研究者们探索的重点。近年来,分子生物学技术的发展,为作物遗传与育
6、种工作提供了新的手段。迄今,在分子水平上对不同形式的氮素转运蛋白及氮代谢相关酶类的研究有了很大的进展[3]。许多有关氮代谢酶基因被鉴定和克隆,为用生物工程的方法提高氮效率提供了有效的途径。 2.1氮素吸收相关基因 虽然高等植物可以利用有机态的氮,但根系主要吸收的氮源还是NO3-和NH4+。近年来,人们从分子水平上对硝态氮的吸收系统进行了大量研究。已发现2种基因NRT1和NRT2与硝态氮转运系统(HATS和LATS)有关。目前已从多种作物中克隆了硝态氮低亲和系统的基因。越来越多的证据表明,铵高亲和转运体应是AMT1家族的成员,原因是AMT蛋白在植物根系吸收土壤氮素中
7、起主要作用。如在拟南芥根系中,AtAMT1;1、AtAMT1;2和AtAMT1;3基因都有充分的表达,而且通过调节这些基因,改变了根系对铵的吸收活力。植物中第1个被发现的AMT1基因是拟南芥中的AtAMT1;3,用核DNA消减法也从酵母铵运转体缺陷型突变体中克隆了此基因。AtAMT2基因在拟南芥的所有器官中都有表达,受氮素的调节,在根系的表达部分受到高浓度硝酸铵的抑制。在地上部分,AtAMT2的表达基本不受根部氮素状态的调节;所以在植物体的所有细胞中,AtAMT2在铵从质外体到共质体的运输中可能有重要作用。 2.2氮素利
