桉树组织培养中的褐化现象及解决途径

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1、桉树组织培养中的褐化现象及解决途径　　摘要：在桉树离体快速繁殖过程中，桉树组培瓶苗极其容易出现“褐化”现象。“褐化”现象大大降低了离体培养的质量与数量，对于大规模的桉树树苗离体培养带来许多不良影响。本文主要论述桉树组织培养中出现“褐化”现象的原因以及解决途径。关键词：桉树组织；褐化；培养基；抑制剂桉树作为工业纸浆生产最为重要的木材原料之一，同时也是世界上最重要的造林树种之一，它具有丰产、速生、优质的特点，具有极高的社会利用价值。世界各国对于桉树的离体培养不断更新，目前许多国家都能够成功地利用桉树离体培养技术达到桉树树苗大规模、工程化培育，并成功将这些培育好的幼苗利用到生态造林工程中去，取

2、得了良好的生态效益和社会效益。但在桉树离体快速繁殖过程中，桉树组培瓶苗极其容易出现“褐化”现象。“褐化”现象大大降低了离体培养的质量与数量，对于大规模的桉树树苗离体培养带来许多不良影响。本文主要论述桉树组织培养中出现“褐化”现象的原因以及解决途径。一、桉树组织培养中产生褐化的形式6桉树组织培养技术通常有两种方法：一是取植株嫩茎段或不定芽接种培养形成愈伤组织分化长成完整植株。二是取无菌种子或无菌发芽后的苗段诱导胚状体生长成完整植株。而褐化现象主要发生在植物愈伤组织的培养过程中，在诱导外植体初分化或者再分化的过程中，桉树外植体自身组织表面释放褐色物质，逐渐导致整个培养基变成褐色，从而导致外植

3、体的生长和分化受到抑制，甚至可能导致外植体死亡。在桉树组织培养过程中，培养基污染、玻璃化、褐化为常见的三个培养问题，但相较而言，褐化的控制比其他两种更加复杂和困难，所以，决定桉树组织培养能否成功的关键就在于能否有效控制褐化现象。褐化现象的主要发生形式可以简单分为酶促褐化和非酶促褐化两种，其中酶促褐化发生的主要原因是因为外植体组织内的酚类物质参与引起的，非酶促褐化现象发生的主要原因则是由于组织细胞受到其他不利于分化、生长的条件引起的细胞死亡所导致的褐化。在桉树外植体组织培养中，较为常见的褐化现象通常是由酶促褐化所造成的。6酶促褐化必须具备酶、底物和氧3个条件，引起桉树产生褐化的酶有过氧化物

4、酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等等，但在众多组织培养试验证明，多酚氧化酶是最为常见诱发褐化的酶类。引起褐变的酶底物主要是酚类化合物，它是一类有害的次生代谢产物，在桉树植物细胞中能与金属离子络合、并且能与蛋白质地和，反应过程中产生的氧化产物醌会与桉树植物细胞内含有的氨基、羟基等化合物进行反应，产生有色物质，形成褐变。二、桉树组织培养中影响褐化的因素桉树组织培养过程中影响褐化产生的主要因素可以从两个方面去分析：一方面是外植体组织自身的生理状态、遗传特性、生长状态等；另一方面是外植体所处在的培养基环境，培养基的组成成分以及培养条件的选择和控制都会对桉树组织培养产生褐化现象造成一定的影响。（一）

5、自身因素在进行桉树组织培养外植体从采集过程中，采取桉树苗或者萌芽条的时间、截取部位不同，都会导致桉树外植体本身的生理状态不同，许多实验证明，3～5月份桉树萌芽率较高，茎部积累有较丰富的营养物质和内源激素，受病虫侵害较少，外植体生理状态较好，7～9月份属高温高湿季节，水分、温度都较高，病虫十分活跃，茎段机械损伤较多，因而外植体本身生理状态不佳，在后续培养过程中容易受到病、虫菌的侵害污染，褐化率较高。与此同时，萌芽条截取部位不同，外植体生长状态也不尽相同，试验证明：萌芽条中上部的茎段（第5～第7节）最好，中下部（第8～第10节）茎段木质化程度较好，芽不易萌动，但容易褐化，梢部因芽组织幼嫩，消

6、毒时易被杀伤，褐化严重。（二）外部培养基因素6桉树组织在进行外植体培养的时候，其培养基的组成成分一般包括有碳水化合物、微量元素、大量元素、维生素、生长素、氨基酸、细胞分裂素等。对于外植体的愈伤组织诱导培养的基本培养基一般可以选用B5、N6、White等。在培养过程中，培养基成分的配比、培养环境如光照时间、光照强度、温度、PH值都会在一定程度上影响到组织培养中的酚类化合物的生成褐化反应，促进或者抑制植物组织的褐化反应。三、桉树组织培养中的褐化解决途径（一）外植体的生理状态选择在进行桉树愈伤组织培养外植体的采集过程中，采集对象主要为嫁接苗或者萌芽条，一般截取具有半木质化程度的嫩梢，长度为5～

7、10cm，外植体的采集最好在春季进行，在芽条腋芽开始膨大、芽鳞片还未裂开时期为最佳时期，保证外植体的内部含有较高水平的营养物质以及内源激素，为外植体的培养提供较高的生理条件。（二）桉树组织预处理控制6在进行培养之前，需要将采回的桉树嫩茎段剪去叶片，用自来水洗干净，并在无菌条件下用70%酒精浸泡10秒钟，再用新洁尔灭溶液或0.1升汞溶液浸5～6分钟消毒，同时用无菌水冲洗4～5次，保证外植体消毒完全。在后续培养过程中，要根据外植体生长状