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1、植物组织培养中的褐变现象及其防止措施 摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。 关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类
2、物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3大难题。目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。1褐变现象的原因1.1非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者
3、愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。 1.2酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶(PPO，PolyphenolOxidase)作用于天然底物酚类物质而引起的。在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化
4、酶释放或合成，如果此时在合适的pH和温度等条件下，酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。此外，组织的老化或病变也可激活酚氧化酶而引起褐变。一般认为,褐化是指外植体或培养材料接种后在组织培养过程中，由于切割造成机械损伤,伤口处分泌出酚类化合物，在有氧的条件下，切面细胞中的酚类物质为多酚氧化酶催化,氧化为醌,醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变,变成棕褐色或暗褐色,并逐渐扩散到培养基中,抑制细胞内其它酶的活性,影响细胞的正常代谢,毒害整个组织,甚至导致组织死亡。
5、尤其是木本植物组织的外植体褐变死亡是其培养难度较大的主要因素。因此,探讨褐化发生的机制及其影响因素,采取有效的防止褐化的措施,是保证植物组织培养成功的关键所在。2影响褐变的因素2.1基因型不同种植物、同种植物的不同类型或品种，在组织培养中发生褐变的频率和程度都存在差异。这是由于各种植物表达的多酚类物质种类、含量以及酚氧化酶的种类、活性存在差异，有些植物种类组织培养较易成功，有些则很困难。一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物高，因而在组培过程中更容易发生褐变。例如在相同的培养基上诱导培养，孝顺竹比小佛肚竹和风尾竹更易
6、褐变[2]。 2.2外植体生理状态材料本身的生理状态不同，接种后褐变的程度也不同。通常分生部位接种后形成醌类物质少而分化的部分形成醌类物质较多，褐变随着材料的组织木质化程度和年龄而增加。植物体内酚类化合物的含量受到取材时间的影响。例如，柿的嫩芽茎尖的多酚氧化酶活性显著高于休眠芽，以嫩枝茎尖为外植体进行培养时易褐变死亡[3]。同年6月份所取的核桃半木质化新植茎芽萌发率高于冬季休眠芽和4月份嫩枝茎芽腋芽，且褐变率及褐变死亡率都较后两者低[4]。 2.3外植体的种类和大小一般认为，木本植物较草本植物的外植体在培养过程中更容
7、易发生褐变。外植体小的材料，由于切口所占比例较大而较易发生褐变。切口越大，酚类物质被氧化的面积就越大，褐变程度越严重[5]。 2.4材料的预处理材料在接种前经过一定预处理可减轻外植体在培养中的褐变。预处理一般有低温或黑暗条件下预培养；外植体在水或抗氧化剂中切割或浸泡，以减少外植体与氧的接触和使水溶性多酚和醌类物质充分的渗出外植体。例如竹在培养时外植体在无菌水或半胱氨酸(100mg/L)溶液中浸泡2～4h有利于控制褐变[6]；魔芋培养过程中，在1%的柠檬酸溶液中切割外植体，可有效抑制外植体褐变；黑暗预处理能减轻蝴蝶兰R
8、4品种叶片外植体的褐变程度，其中以预处理10d的褐变最轻;未经暗处理的褐变最重且多酚氧化酶(PPO)活性最大[7]。 2.5培养条件培养过程中,低温比高温有利于抑制褐变，高温会促进酚类氧化;而低温抑制酚类合成，降低多酚氧化酶的活性,减少酚类氧化。暗培养或弱光培养对抑制褐变也有一定的作用。例如小佛肚竹在暗培养和弱光(800Lx)下培养的茎尖和茎段
