双水相萃取脂肪酶

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1、双水相萃取脂肪酶摘要：本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术，探究了双水相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果。同时也介绍了一些蛋白质含量及酶活检测的基本方法。前言脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一种能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，在生物体内是一种重要的代谢酶，在食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学以及环境、能源等领域也有非常广泛应用[1]－[2]。工业上常用的脂肪酶大多是由微生物发酵得到，但是发酵得到的只是含有杂质较多的粗酶液，要得到能够满足工业生产要求的脂肪酶还需要经过进一步的分离和纯化。现在用于脂肪酶分离纯化的方法大

2、多是常见的蛋白质分离方法，比如各种层析，电泳以及离心等方法。但是在酶的分离过程中还需要考虑到保持酶活、提高回收效率以及降低成本等因素，一般的分离方法对酶的分离提纯的效果并不很理想，所以寻找一种高效实用的提纯方法对脂肪酶在工业生产中的应用是非常重要的。双水相萃取技术是近年来基于液－液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型分离方法。是利用生物大分子物质在由高聚物/高聚物/水或者高聚物/无机盐/水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离的。1956年，瑞典Lund大学的Albertsson首次利用双水相萃取技术来分离生物物质，研究了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细

3、胞颗粒在双水相体系中的分配行为，这是双水相萃取方法在生物大分子分离提纯中的最早应用[3]，国内对于双水相萃取方法的研究也早在20世纪60年代就已经开始了。与传统的蛋白质分离提纯方法相比，双水相萃取方法具有很多优点：体系含水量高，可达80％以上；蛋白质在其中不易变性；界面张力远远低于水－有机溶剂两相体系的界面张力，一般为0.5～10-4mN*m-1，有助于强化相际间的质量传递；系统中的传质和平均速度快，能耗小，分相时间短，一般只要5～15min；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等[4]－[5]。双水相萃取的方法在

4、蛋白质、酶、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化等领域中得到了广泛的应用。所以这种分离方法在蛋白质以及酶的分离提纯中有着很大的应用前景。现在研究最多的双水相体系有高聚物/高聚物以及高聚物/无机盐体系，常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等，无机盐主要有磷酸盐、硫酸盐等。本实验所采用的就是PEG/硫酸盐体系，另外对于一种不是很常见的双水相体系表面活性剂双水相体系也做了一些探究。一、实验原理：双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分离的。当双水相体系中的两种物质浓度达到一定比例时，就会形成两个稳定的且互不相溶的两

5、相，由于脂肪酶在这两相中的分配系数不同，就会自动的向分配系数高的一相中移动，而其它的杂质则分配到另一相，这样就达到了分离提纯的目的。由于两相都是水相，所以一般对于酶的活性及稳定性不会有太大的影响。为了得到适合的两相配比，就要通过绘制相图来进行分析，相图的绘制就是通过调整两相比例，得到能够分相的临界点，从而得到相图。蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对照标准曲线即可得到蛋白质含量。酶活的检测方法则有滴定法和pNPP法，滴定法是以橄榄油乳化液为底物，通过检测脂肪酶水解橄榄油得到的脂肪酸来确定其活性。而pNPP法则是利用脂肪酶水解4-

6、硝基苯基磷酸二钠盐（pNPP）得到有颜色的对硝基苯酚（pNP）[11]，然后通过分光光度计检测其吸光度，对照标准曲线得到酶活。脂肪酶经过双水相的初步分离后，还要通过凝胶过滤的方法对其进行进一步的分离和纯化，从而达到更高的纯度。但是经过双水相后，体系中有大量的PEG（脂肪酶主要分配在PEG相）从而不能直接经过凝胶过滤，还需要采取一定手段去除过量的PEG，可以采用PEG沉淀的方法或者反萃取来去除多余的PEG。本实验采用的是PEG/（NH4）2SO4体系和SDS/CTAB体系两种双水相。PEG/（NH4）2SO4体系是较为常用的一种双水相体系，以前也有人做过相关的研究，证明

7、这种体系对于脂肪酶的分离提纯效果比较好[6]－[8]。SDS/CTAB体系是一种表面活性剂双水相体系，国内也有对此类双水相体系的分配行为及在蛋白质及氨基酸等大分子物质的分离提纯中的应用，但并没有人将其用于脂肪酶的分离提纯[9]-[10]。二、实验用品：实验材料：假单胞菌脂肪酶（由假单胞菌发酵制备）实验仪器：紫外可见分光光度计，离心机，乳化机，恒温摇床，恒温水浴锅，PH计实验药品及配制方法：PEG1000，（NH4）2SO4，十二烷基硫酸钠（SDS），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），橄榄油，2%聚乙烯醇（PVA）溶液，糊精，蛋白胨，K2HPO4·3H