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时间:2018-05-07
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1、人乳头状瘤病毒检测的研究进展【关键词】宫颈肿瘤;头状瘤病毒,人乳宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在女性恶性肿瘤中居第二位,仅次于乳腺癌[1]。近年宫颈癌的发病呈上升趋势以及年轻化趋势[2]。人类首次发现人乳头状瘤病毒(HPV),是一种可致软疣的病毒,后来被国际癌症研究中心定为致宫颈癌及其相关病变的关键因素[3],在99.7%宫颈癌中可检出HPV[4]。HPV是人类致瘤病毒中最具有多样性的一类,至今已鉴定出一百多型,世界卫生组织2005年公布了15种型别HPV有致癌性[5],主要导致宫颈浸润癌[3]:HPV16、HPV18、HPV31
2、、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73和HPV82,称为高危型HPV。Zuan等[6]的研究认为宫颈上皮高度病变合并HPV16、HPV18、HPV33或HPV45型感染时则会大大提高病变进展为宫颈癌的可能性。在人宫颈癌标本中HPV-DNA的检出率可高达99%,其中HPV-16、HPV-18阳性率分别为60%、14%[7],因此对感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性。现就国内外对HPV检测方法的研究进展综述如下。 1HPV检测方法
3、1.1传统的细胞学检测方法 1.1.1细胞学检查细胞学技术是检测HPV感染的一种简便而经济的方法,常用于HPV的过筛检查。它通过HPV感染所致宿主细胞发生的形态学改变而推断HPV感染的发生,临床上应用较多的方法是传统的巴氏涂片法,但由于其局限性已逐渐被美国国立癌症研究所提出的Bethesda系统报告方式所取代。 1.1.2液基细胞学液基细胞学检测改变了常规涂片的操作方法,标本取出后立即装入有特殊细胞保存液的容器中,几乎保留了取材器上的所有细胞,经高精密度滤器过滤制成均匀薄层涂片,在薄片中不正常的细胞容易被观察,并且湿固定的细胞核结构清
4、晰易于鉴别。而在Pap涂片中假阴性高达53%~90%[8,9],产生原因除病变细胞没有取到外,主要有以下两种原因:①取材器上的病变细胞没有被转移到载玻片上;②涂片质量差,不均匀过厚,过多黏液、血液或炎症细胞遮盖了不正常的细胞,有40%的涂片因质量影响正常诊断[10]。液基细胞学检测与Pap涂片技术相比,使发现低度病变的敏感度提高10%~15%。 1.1.3组织病理学检查大多数病理学家认为“挖空细胞”对诊断HPV感染有特异性但并非惟一的诊断依据。如今已发现,“挖空细胞”作为组织学诊断标准,其特异度为95.26%、灵敏度为77.93%、假阳
5、性率为4.47%、假阴性率为22.0%。因此,须结合其他镜下形态综合分析以作出正确诊断。 2HPV-DNA检测方法 2.1杂交法 2.1.1传统杂交法主要是利用放射性核素标记已知的核酸片段。在一定的条件下,与待测的具有一定同源性的核酸片段按碱基互补配对的原则形成双链。常用的HPV-DNA的核酸杂交方法有DNA印迹法、斑点杂交和原位杂交等。DNA印迹法灵敏度高,与聚合酶链反应(PCR)联合,理论上可检测1个病毒/细胞,适用于分型HPV-DNA分子质量鉴定等,但其过于复杂和繁琐,且必须应用新鲜组织标本,故仅用于实验室研究,目前还不便于临
6、床应用。斑点法操作简单、迅速,特异性强,敏感性高,但原位杂交法敏感性低,临床亦少用。 2.1.2新型杂交法新型杂交法主要是指第2代杂交捕获技术和导流杂交技术。杂交捕获技术是美国Digene公司最近几年发明的一种检测HPV-DNA的技术,其原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测以诊断HPV感染。到目前为止,杂交捕获技术经历了3个阶段的发展,即杂交捕获技术-1、杂交捕获技术-2和杂交捕获技术-3。杂交捕获第2代技术操作简单,无需基因扩增,重复性好,对高危HPV检测的敏感率高达89%~98%,阴性预测值可达99%[11],且实验结
7、果客观不受人为和地理条件的限制。杂交捕获技术-2比杂交捕获技术-1更可靠,其检测低限为HPV-DNA0.2~1pg/m[12],由于这段寡核苷酸与HPV-DNA的另一段序列互补,从而减少了非特异性杂交造成的假阳性结果[13]。这种检测方法能特异地检测出靶序列的单个核苷酸的改变,而使检测HPV基因型变异体成为可能。 2.2PCR技术以PCR为基础的检测方法,是进行HPV-PCR检测及分型的最好方法。PCR技术采用DNA聚合酶催化特异性引物来选择性地扩增靶HPV-DNA。对扩增后的DNA可采用不同的方法进行检测。PCR能检出标本中的10~1
8、00个DNA分子,它是目前最为灵敏的方法[14],主要包括荧光定量PCR[15]、实时PCR、间接原位PCR等。尚有PCR-酶联免疫吸附试验检测、PCR结合双向点杂交技术检测、竞争性定量PCR
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