口蹄疫病毒vp1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

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1、口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达：李杰,王若,石玮,边海霞,张丽,张雷,王家鑫【摘要】目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体,转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendriticcell,DC)。方法:将pMD18VP1克隆于pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒,酶切鉴定,DNA测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染DC,经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆,用DVVP1基因在DC中的表达。结果:构建的pcDNA3.1VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性,SDSPAGE和:Toconstr

2、ucttheeukaryoticexpressionvectorsfortheFMDVVP1geneandtransfectdendriticcells(DC)fortheexpressionofVP1.METHODS:TheplasmidpMD18VP1idsnamedaspcDNA3.1VP1.TherebinantplasmidsinemethodandthepositivecellclonesinedbyDV)分为O、A、C、AsiaI、SAT1、SAT2和SAT3等7个血清型。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4各60分子组成,其中VP1为主要的抗

3、原蛋白,在已发现的O型5个抗原位点中有3个位于VP1上。在VP1第140～160位氨基酸处有一个长的、结构稳定的GH环,环上的氨基酸构成能刺激免疫应答的T、B细胞抗原表位,是病毒表面的主要抗原位点,在其顶部形成一个高度保守的ArgGlyAsp(RGD)序列,是FMDV与宿主细胞受体相结合的位点[1,2]。VP1是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的最重要的结构蛋白,它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面,在免疫应答中发挥着主要作用[3]。因此,VP1成为各类新型疫苗研究的主要抗原之一。DC是目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞,并能以交叉途径提呈非复制性抗原,激活CD8+T细胞,

4、从而发挥对病原体的杀伤作用[4]。基因转染的DC可以激活CD8+T细胞产生IFNγ[5],并诱导CD4+T细胞产生更多的Th1型细胞因子,因此,基于DC的基因工程研究已成为抗病毒免疫的一个热点问题[6]。有报道显示,DC在机体抗FMDV感染免疫中发挥重要作用[7],但野毒感染可造成DC功能严重损伤。同时,由于对FMDV的灭活处理可直接改变病毒蛋白的抗原性质,所以用灭活FMDV作为抗原研究DC提呈抗原的机制则不能反映机体的自然过程。因此,将FMDV的VP1基因转染DC,使其表达VP1就成为研究DC提呈FMDV抗原机制的理想途径之一。本研究中,我们构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达质

5、粒pcDNA3.1VP1,利用脂质体转染DC,得到了稳定表达。　　1材料和方法　　1.1材料O型FMDV的pMD18VP1质粒由军事兽医学研究所金宁一教授惠赠,大肠杆菌感受态细胞DH5α和普通质粒小提试剂盒购自北京天根公司,凝胶回收试剂盒、T4连接酶、EcoRI、HindIII、SacI限制性内切酶购自大连宝生物公司,D7500和D2000为北京天根公司产品,LipofectamineTM2000Reagent为invitrogen公司产品。G418为Solarbio公司产品。仓鼠抗小鼠CD11c购于BioLegend公司,异硫氰酸荧光素标记(FITC)羊抗仓鼠IgG和FITC

6、标记羊抗小鼠IgG购于eBioscience公司,FITC标记羊抗兔IgG购SantaCruz公司,小鼠抗MHCClassⅡ1Ab购于Chemicon公司,硝酸纤维膜(NC0.45μm)购于ScientificResearchSpecial公司。　　1.2方法　　1.2.1单核细胞源树突状细胞(MoDCs)的制备无菌条件下,用摘眼球法进行BALB/c小鼠采血,放入含肝素钠的离心管中,摇匀。加入等量的Hank’s液,混匀。然后轻轻至于淋巴细胞分离液上,使二者之间有一清晰界面,室温下,以2000g离心20min。用滴管吸出中间薄层细胞,用Hank’s液悬浮细胞,室温下,以1500g离心

7、10min,洗涤2次。弃去上清液,然后用RPMI1640完全培养液将细胞悬液加入到培养瓶中,置37℃、50mL/LCO2培养箱中孵育3h后弃上清液,用37℃预热RPMI1640完全培养液轻轻洗涤贴壁细胞2次,去除非贴壁细胞,即得贴壁单核细胞。在培养瓶中加入含20μg/LrmGMCSF和20μg/LrmIL4的RPMI1640完全培养液中培养,每隔两天半量换液1次,补充新鲜培养液,连续3次。第7天,弃去非贴壁细胞,加入5mL,5mol/LEDTA/PBS