大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究

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1、大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究　　前言　　　　黑素瘤作为一种起源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统色素沉积区域的黑色素细胞的高度恶性肿瘤，是一种由异常黑色素细胞过度增生引发的常见皮肤恶性肿瘤，是皮肤癌的前期症状[1-3].在所有的皮肤恶性肿瘤中黑素瘤的发病率居第三位，占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，近年来国内外发病率呈不断上升趋势。目前治疗黑素瘤的主要方法是是外科手术切除和放化疗，然而手术创伤大，局部广泛切除后还需再进行植皮手术，放化疗则副反应大，在杀灭肿瘤细胞的同时也杀灭了正常细胞。　　近年来，低温等离子体（L

2、operaturePlasma,LTP）在生物医学领域的应用越来越广泛，主要集中在废液废气、医疗器械、食品等的消毒灭菌和改善医用生物材料的生物相容性等方面，已取得了显着的成效，被国内外大量研究所证实[4].同时，LTP也逐步开始应用于对人和动物活细胞的处理，人们尝试着使用LTP来取代或者辅助传统的医疗手段和医疗器械，已初步取得了一些令人满意的成果[5].　　但传统的LTP源因产生的等离子体位于两个电极之间或放电效率和活性粒子浓度较低，无法作用于实际人或动物身上的活体细胞或处理效率十分低。因此研究者们利用气流和电场

3、的共同作用开发了一种新颖的LTP产生方法，即大气压等离子体射流（AtmosphericPressurePlasmaJet,APPJ），将放电区域所产生的等离子体从射流管口喷出。相比于传统的LTP产生方法，APPJ具有无需密封系统、放电区域与工作区域分离、活性粒子可随气流而作用于对象表面、便于调控和处理三维复杂曲面结构的对象等优点，已逐步被人们应用于生物医学领域、材料表面改性、表面刻蚀、薄膜制备等领域，表现出独特的技术优势和良好的应用前景[6-8].由于APPJ可精确定位于肿瘤组织，从而避免对正常细胞和组织的破坏，

4、具有创伤小和副反应小的优点。因此如可采用APPJ等手段，来代替手术切除、化疗等常用医疗手段或医疗器械，不仅可以减轻药物所带来的副作用和化疗手段所带来的巨大疼痛，还可以达到经济有效治疗的目的。　　本实验首先通过两种APPJ装置，将小鼠体外黑素瘤作为APPJ作用的研究对象，通过对等离子体参数与成分的诊断和作用前后黑素瘤细胞相关参数（存活数、细胞周期分布、凋亡率和黑素含量合成等）的检测，来考察和探索APPJ对黑素瘤细胞生长的抑制作用及相关机制。有望为APPJ治疗皮肤恶性肿瘤提供理论基础，并期望提出治疗恶性肿瘤可能的新方

5、法，进而减少疾病的折磨，造福于社会。　　1大气压等离子体射流对黑素瘤作用的研究　　　　1.1实验方法　　　　实验中选用小鼠黑素瘤细胞（B16）进行体外培养，所使用培养液为RPMI-1640细胞培养液（含10%小牛血清，100U/mL青霉素与0.1mg/L链霉素），置于37℃，5%CO2孵育箱孵育，每三天更换一次培养液，次，待成纤维细胞长满瓶壁，用0.25%胰蛋白酶消化，并用PBS将细胞浓度调至1106/mL.　　培养完毕后将细胞从培养瓶壁上消化下，离心后加入培养液进行吹打，随后将含有细胞的培养液加入医用96孔板，

6、因96孔板的孔径与石英管APPJ的大小差不多，因此我们选用了石英管ArAPPJ置于96孔板上方来处理小鼠黑素瘤细胞。实验在常气压下的超净工作台中进行。试验环境条件为：室温20℃，相对湿度60%.实验数据以±SD（均数±标准差）形式表示，均数间的差异采用随机区组方差分析方法检验，采用SPSS13.0统计软件分析。　　1.2实验结果与分析　　　　1.2.1细胞存活能力、酪氨酸酶活性及黑色素含量的检测采用四唑盐比色实验来检测细胞的存活能力，所用的显色剂为噻唑蓝，简称为MTT.在一定细胞数范围

7、内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，用以检测等离子体是否对癌细胞总量有减少或抑制作用。黑色素合成能力的检测采用酪氨酸酶活性实验。黑色素含量则用于判断APPJ处理是否减少了黑素瘤细胞的合成黑色素量。以上三种方法在不同APPJ处理时间下的检测结果均通过分光度来表示，如图4所示。可见，以上三种检测实验的OD值均随着APPJ处理时间的增长而逐渐减小，意味着细胞存活能力、黑色素合成能力及黑色素含量快速下降，黑素瘤细胞的生长和活性得到了一定程度的抑制。当APPJ处理时间4s以上，相比于控制组，三种检测实验的OD值开始剧烈下

8、降，差异有统计学意义（P<0.05）。【1】　　1.2.2电子透射电镜的观察利用电子透射电镜（TEM）观察APPJ处理前后黑素瘤细胞的形貌变化情况。具体步骤如下：将经APPJ处理后的悬浊液，在3000g下离心10min,弃去上清液；沉淀由PBS清洗3次，每次3000g,5min;加入2mL戊二醇（2.5%）在4°C下固定24h,之后用0.1M的PBS浸洗30