不同截短u3启动子在棉花中的功能分析

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1、棉花学报CottonScience2016,28(3):307―314不同截短U3启动子在棉花中的功能分析12111*1*雷建峰袁徐新霞袁代培红袁李继洋袁张巨松袁刘晓东渊1.新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室袁新疆乌鲁木齐830052曰2.新疆巴州农业技术推广中心袁新疆库尔勒841000冤摘要院从海岛棉中克隆了2种GbU3-2P尧GbU3-3P启动子袁对它们进行2种长度截短袁长度分别为436尧245bp和384尧233bp袁同时构建了4个相应启动子驱动的融合植物表达载体遥利用农杆菌真空渗透转化法将4个GbU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300植物表达载体分别转

2、染棉花胚性愈伤组织遥经GUS组织化学染色显示院克隆得到的2种截短大小的GbU3-2P和GbU3-3P启动子均能驱动基因在棉花愈伤组织中表达袁棉花愈伤组织被染成蓝色袁但颜色深浅没有显著差异遥本研究表明袁同一GbU3启动子截短后袁较短的启动子和较长的启动子具有相同的转录活性遥这为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了更多理想的启动子遥关键词院棉花曰GbU3启动子曰截短克隆曰真空渗透曰愈伤组织中图分类号院S562.03文献标志码院A文章编号院1002-7807渊2016冤03-0307-0810.11963/issn.1002-7807.2016030151211*1*L

3、eiJianfeng,XuXinxia,DaiPeihong,LiJiyang1,ZhangJusong,LiuXiaodong(1.830052,2.841000,TheU3promoterisanimportantelementforthetranscriptionofsgRNAintheCRISPR/Cas9genomeeditingsystem.TworoundsofPCRwereperformedtoclonedifferenttruncatedGbU3-2PandGbU3-3PpromotersfromL.;lengthswere436and245bp,and384an

4、d233bp,respectively.GUSfusionexpressionvectorswereconstructedusingthefourGbU3promoters.Next,fourGbU3Ps∷GUS-sgRNA-P1300plantexpressionvectorsweretransformedintocottonembryo-geniccallusbyvacuuminfiltrationtransformation.GUShistochemicalstainingresultsrevealedthatbothtruncatedGbU3-2PandGbU3-3Ppro

5、moterscoulddrivegeneexpressionincottoncallus,andallcorrespondingcottoncalluscouldbestainedbluewithoutsignificantdifferencesincolordepth.TheseresultsdemonstratedthatthetwotruncatedGbU3promotershadthesametranscriptionalactivityregardlessofthepromoterbeinglongorshort.Thisworkprovidesidealpromoter

6、sfortheconstructionofaCRISPR/Cas9genomeeditingsystemforuseincottonfunctionalgenomics.cotton;GbU3promoter;truncatedcloning;vacuuminfiltration;cottoncallus基因组编辑技术不仅在植物基因功能的研核酸酶靶向结合到目标基因上进行打靶遥在生物究中发挥作用袁而且还可以用来创造出有用的育体内袁sgRNA的转录通常由U3启动子或者U6[1-2]种材料遥Ⅱ型CRISPR/Cas9是2013年兴起的启动子驱动表达袁二者有着明确的转录起始位[3-4]一种

7、最新的基因组编辑技术遥该系统需要一个点院U3启动子以耶A爷碱基开头袁而U6启动子转录[5-6]9内切核酸酶和一段能与靶基因结合的sgR-起始位点以耶G爷碱基开头遥选择具有明确转录NA袁其中sgRNA是由crRNA和tracerRNA融合起始位点的U3或U6启动子可以精确转录sgR-而成遥在基因编辑过程中袁sgRNA引导9内切NA袁杜绝无关序列所带来的脱靶效应遥收稿日期院2015-12-18作者简介院雷建峰(1989―)袁男袁硕士研究生袁15299175640@163.