07生技074120304刘治敏毕业论文

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1、重组木聚糖酶XynAHJ3的酶学性质研究姓名:刘治敏　　专业:生物技术指导教师:李俊俊摘要：本文主要介绍重组木聚糖酶XynAHJ3的酶学性质以及应用。结果表明：该木聚糖酶XynAHJ3的最适反应温度为70℃，在20℃和80℃下都具有酶活性；60℃下XynAHJ3的半衰期60min，70℃下很快失活；酶反应最适反应pH为6.0，在pH12.0时仍具有25%以上的酶活；经pH4.0–11.0的缓冲液处理1h，酶活剩余90%以上；10mM的Ag+和Hg2+可完全抑制XynAHJ3；Fe3+、Cu2+、Mn2+、Pb2+及10%（v/v）乙醇对XynA

2、HJ3的抑制较强；Zn2+、Co2+及Fe2+对XynAHJ3的抑制较弱（剩余酶活>60%）；β-mercaptoethanol可使XynAHJ3的酶活提高~0.3倍；其余金属离子和化学试剂对XynAHJ3的影响很小，10mM及100mM的SDS未能使XynAHJ3失活。关键词：木聚糖酶；酶学性质；酶活前言：木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶。一个木聚糖分子的完全酶解需要几步酶促反应，其中作用于主链的酶有两种：β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。一般而言，前者从主链内部作用于

3、木糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖，而后者则作用于低聚木糖的末端，释放出木糖[1]。对木聚糖酶的研究早在60年代就已开始，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同性质的木聚糖酶[2]。木聚糖酶的酶学性质决定了其在应用上的潜力及应用领域，一般要求木聚糖酶有较高的催化效率、较好的抗逆性、较广的pH和温度适应范围等。近年来，大量有关木聚糖酶结构与功能的研究不断展开,一方面加深了对木聚糖酶作用的分子机理的了解,另一方面为通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质、研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品提供了指导。现在已知能够产生木聚糖酶的菌种包

4、括细菌、真菌、黑曲酶、木霉等，不同来源的木聚糖酶的催化特性是有差异的,有不同的最适pH和最适作用温度，金属离子对不同来源的木聚糖酶活性的影响各不相同[3-4-5]。从产木聚糖酶的菌种的筛选，目的基因的提取以及转入大肠杆菌中表达，用IPTG诱导产酶，酶的提纯，最后进行酶学性质的测定，其一序列的流程目的是为了获得木聚糖酶的高产菌株，有望应用于食品及饲料等产业，为更好的服务社会。对实验室木聚糖酶XynAHJ3整个获取流程有一定的了解，本文重点是对其酶学性质的研究。91实验材料1.1菌株菌种：Lechevalieriasp.HJ3，实验室保存表达载体：

5、pET28a（+），表达菌株：大肠杆菌BL21（DE3）工程菌：实验室已前期构建1.2培养基LB：1％tryptone，0.5％yeastextract，1％NaCl。121℃高压灭菌30min。1.3试剂配制(1)DNS溶液：称取6．3g3，5-二硝基水杨酸和262mL2mol/L的NaOH，加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到入1000mL，溶液为黄色，室温存放在棕色瓶中，至少一周后方可使用。(2)D(+)-木糖溶液：lg木糖溶解于pH值为7．0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲

6、液上述中，定容至100mL，室温下保存。(3)0.05mol／L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(4)0.05mol／LTris-HCl缓冲液(5)O.05mol／LGly-NaOH缓冲液(6)0.5％木聚糖底物溶液：2.5g桦木木聚糖溶解于pH值为7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，定容至500mL，室温下保存。(7)10mM的金属离子化合物、螯合剂(EDTA)和表面活性剂(SDS)(水对照)的缓冲液。1.4实验仪器型号生产厂家(1)分析天平PL203梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司(2)离心机Centrifuge5418德国eppendorf公司

7、(3)高速冷冻离心机Centrifuge5810R德国eppendorf公司(4)分子水浴锅HAAKEDC10德国HAAKE公司(5)灭菌锅TDGC2-3天正集团有限公司(6)振荡器(7)pH仪(8)分光光度计(9)移液枪，锥形瓶，容量瓶，试管若干92实验方法2.1重组木聚糖酶XynAHJ3酶活力测定木聚糖酶在一定条件（pH7.0，37℃)下，催化水解底物木聚糖生成木糖等还原糖，还原糖又同DNS试剂发生显色反应，用分光光度计测定其吸光度，计算酶活力。酶活力单位定义：在37℃,pH7.0条件下，每mL待测酶液每min催化底物生成1μmol木糖所需

8、的酶量为一个酶活力单位(U)。(1)木糖标准曲线的绘制分别吸取l0mmol／ml木糖标准液0、25、50、100、150、200μl，放于六只带塞的磨