KJ 202101 食品中赭曲霉毒素A的快速检测 胶体金免疫层析法

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食品快速检验方法犓犑２０２１０１食品中赭曲霉毒素犃的快速检测胶体金免疫层析法２０２１０１１３发布国家市场监督管理总局发布

1犓犑２０２１０１食品中赭曲霉毒素犃的快速检测胶体金免疫层析法１范围本方法规定了食品中赭曲霉毒素Ａ的快速检测胶体金免疫层析法。本方法适用于谷物（燕麦除外）、葡萄酒、烘焙咖啡豆、研磨咖啡（烘焙咖啡）和速溶咖啡中赭曲霉毒素Ａ的快速测定。２原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理，样品中的赭曲霉毒素Ａ经提取与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和试纸条中检测线（Ｔ线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（Ｔ线）与控制线（Ｃ线）颜色深浅比较，对样品中赭曲霉毒素Ａ进行定性判定。３试剂与材料３．１试剂除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的二级水。３．１．１甲醇。３．１．２乙腈。３．１．３无水乙醇。３．１．４盐酸。３．１．５三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ碱）。３．１．６氯化钠。３．１．７氯化钾。３．１．８磷酸氢二钠。３．１．９磷酸二氢钾。３．２试剂配制３．２．１甲醇乙腈（５０＋５０）：分别量取５０ｍＬ甲醇（３．１．１）、５０ｍＬ乙腈（３．１．２），混合均匀。３．２．２盐酸溶液（１＋１）：量取５０ｍＬ盐酸（３．１．４）缓慢倒入４０ｍＬ水中，定容至１００ｍＬ，混匀。３．２．３谷物稀释液：称取Ｔｒｉｓ碱（３．１．５）２４２．２８ｇ，加入６００ｍＬ水，充分搅拌溶解后用盐酸溶液（３．２．２）将ｐＨ值调节至８．０，向溶液中加入氯化钠２０ｇ（３．１．６）充分搅拌至溶解，加水定容至１Ｌ，或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套稀释液。３．２．４葡萄酒稀释液：称取Ｔｒｉｓ碱（３．１．５）２４２．２８ｇ，加入６００ｍＬ的水，充分搅拌溶解后，用盐酸溶液（３．２．２）将ｐＨ值调节至７．５，向溶液中加入氯化钠（３．１．６）２０ｇ，充分搅拌至溶解，加水定容至１Ｌ。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套稀释液。３．２．５咖啡复溶液：分别称取氯化钠（３．１．６）１６０．０ｇ、氯化钾（３．１．７）４．０ｇ、磷酸氢二钠（３．１．８）７１．６ｇ、磷１

2犓犑２０２１０１酸二氢钾（３．１．９）４．８ｇ于１０００ｍＬ烧杯中，加水充分搅拌溶解后转移至１０００ｍＬ容量瓶中定容。取上述溶液５０ｍＬ加入９５０ｍＬ水混合均匀，即为咖啡复溶液。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套复溶液。３．３标准品赭曲霉毒素Ａ标准品：纯度≥９９％，或经国家认证并授予有证标准物质证书的标准物质。其中文名称、英文名称、ＣＡＳ号、分子式、相对分子质量见表１。表１赭曲霉毒素犃的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称ＣＡＳ号分子式相对分子质量赭曲霉毒素ＡＯｃｈｒａｔｏｘｉｎＡ３０３４７９Ｃ２０Ｈ１８ＣｌＮＯ６４０３．８１３．４标准溶液配制３．４．１赭曲霉毒素Ａ标准储备溶液（１００μｇ／ｍＬ）：准确称取适量的赭曲霉毒素Ａ标准品（３．３）于烧杯中溶解后转移至１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）溶解并稀释至刻度，摇匀，配成１００μｇ／ｍＬ的赭曲霉毒素Ａ标准储备液。在－２０℃保存，可使用３个月。３．４．２赭曲霉毒素Ａ标准工作液Ａ（１μｇ／ｍＬ）：准确量取赭曲霉毒素Ａ标准储备溶液（１００μｇ／ｍＬ）（３．４．１）１ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）稀释至刻度，摇匀。于４℃避光保存，可使用７天。３．４．３赭曲霉毒素Ａ标准工作液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）：准确量取赭曲霉毒素Ａ标准工作液Ａ（１μｇ／ｍＬ）（３．４．２）１０ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇乙腈（５０＋５０）（３．２．１）稀释至刻度，摇匀。临用现配。３．５材料赭曲霉毒素Ａ胶体金免疫层析试剂盒：金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）、试纸条。需在阴凉、干燥、避光条件下保存。４设备与仪器４．１电子天平：感量分别为０．０１ｇ和０．１ｍｇ。４．２粉碎机。４．３涡漩混合器。４．４离心机：≥４０００ｒ／ｍｉｎ。４．５移液器：１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ、５ｍＬ。４．６氮吹仪。４．７ｐＨ计。４．８筛网：０．５ｍｍ～１ｍｍ孔径。５环境条件环境温度：１５℃～３０℃；相对湿度：≤８０％。２

3犓犑２０２１０１６分析步骤６．１试样制备谷物、烘焙咖啡豆：取具有代表性样品约１ｋｇ，用高速粉碎机将其粉碎，全部通过０．５ｍｍ～１ｍｍ孔径试验筛，过筛，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。焙烤咖啡、速溶咖啡：取具有代表性样品约１ｋｇ，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。葡萄酒：取代表性样品混合均匀。６．２试样提取６．２．１谷物准确称取试样５ｇ（精确至０．０１ｇ），置于５０ｍＬ离心管中，依次加入２０ｍＬ水，１ｍＬ谷物稀释液（３．２．３），涡漩混匀１ｍｉｎ后静置３０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，上清液即为待测液。６．２．２葡萄酒吸取４００μＬ试样于５ｍＬ离心管中，依次加入１１６０μＬ水，４０μＬ葡萄酒稀释液（３．２．４），涡漩混匀３０ｓ后静置３０ｍｉｎ，混匀后的液体即为待测液。６．２．３烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡准确称取试样１ｇ（精确至０．０１ｇ），置于１５ｍＬ离心管中，加入８ｍＬ无水乙醇（３．１．３），涡漩混匀１ｍｉｎ后静置３０ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ。取１ｍＬ上清液，于５０℃水浴中氮气吹干。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡加入０．５ｍＬ咖啡复溶液（３．２．５），速溶咖啡加入１ｍＬ咖啡复溶液（３．２．５），涡漩混匀１ｍｉｎ，作为待测液。注：试样提取（６．２）过程可按照试剂盒说明书操作。６．３测定步骤吸取２００μＬ上述待测液于金标微孔中，抽吸至孔底颗粒完全溶解，室温条件下进行孵育：谷物孵育３ｍｉｎ，葡萄酒孵育３ｍｉｎ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡孵育４ｍｉｎ。将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温条件下谷物反应３ｍｉｎ，葡萄酒反应６ｍｉｎ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡反应４ｍｉｎ。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。注：测定步骤（６．３）也可按照试剂盒说明书进行。６．４质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。６．４．１空白试验称取空白试样，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。６．４．２加标质控试验谷物样品：准确称取空白样品５ｇ（精确至０．０１ｇ）置于５０ｍＬ具塞离心管中，加入２５０μＬ赭曲霉毒３

4犓犑２０２１０１素Ａ标准中间液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使谷物中赭曲霉毒素Ａ浓度为５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡样品：准确称取空白样品１ｇ（精确至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ具塞离心管中，加入５０μＬ赭曲霉毒素Ａ标准中间液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使焙烤咖啡豆、焙烤咖啡中赭曲霉毒素Ａ浓度为５μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。速溶咖啡样品：准确称取空白样品１ｇ（精确至０．０１ｇ）置于１５ｍＬ具塞离心管中，加入１００μＬ赭曲霉毒素Ａ标准中间液Ｂ（０．１μｇ／ｍＬ）（３．４．３），使速溶咖啡中赭曲霉毒素Ａ浓度为１０μｇ／ｋｇ，按照６．２和６．３步骤与样品同法操作。７结果判定通过对比质控线（Ｃ线）和检测线（Ｔ线）的颜色深浅进行结果判定，见图１目视判定示意图。７．１无效控制线（Ｃ线）不显色，无论检测线（Ｔ线）是否显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效。７．２阳性结果控制线（Ｃ线）显色，检测线（Ｔ线）不显色或颜色浅于控制线（Ｃ线），表明样品中赭曲霉毒素Ａ高于方法检测限，判为阳性。７．３阴性结果控制线（Ｃ线）显色，检测线（Ｔ线）颜色深于控制线（Ｃ线）或与控制线（Ｃ线）颜色基本一致，表明样品中赭曲霉毒素Ａ低于方法检测限，判为阴性。图１目视判定示意图４

5犓犑２０２１０１７．４质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。８结论本方法筛查出的阳性样品应按照ＧＢ２７６１指定方法标准进行确证。９性能指标９．１检出限谷物为５μｇ／ｋｇ；葡萄酒为２μｇ／ｋｇ；烘焙咖啡豆、焙烤咖啡为５μｇ／ｋｇ；速溶咖啡为１０μｇ／ｋｇ。９．２灵敏度灵敏度≥９５％。９．３特异性特异性≥９５％。９．４假阴性率假阴性率≤５％。９．５假阳性率假阳性率≤５％。注：性能指标计算方法见附录Ａ。１０其他本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。本方法参比标准为ＧＢ５００９．９６—２０１６《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素Ａ的测定》（包括所有的修改单）。５

6犓犑２０２１０１附录犃（规范性）定性方法性能指标计算表定性方法各个性能指标计算见表Ａ．１。表犃．１定性方法性能指标计算表检测结果ｂ样品情况ａ总数阳性阴性阳性犖１１犖１２犖１．＝犖１１＋犖１２阴性犖２１犖２２犖２．＝犖２１＋犖２２总数犖．１＝犖１１＋犖１２犖．２＝犖２１＋犖２２犖＝犖１．＋犖２．或犖．１＋犖．２显著性差异（χ２）χ２＝（｜犖１２－犖２１｜－１）２／（犖１２＋犖２１），自由度（犱犳）＝１灵敏度（狆＋）／％狆＋＝犖１１／犖１．×１００特异性（狆－）／％狆－＝犖２２／犖２．×１００假阴性率（狆犳）／％狆犳－＝犖１２／犖１．×１００＝１００－灵敏度假阳性率（狆犳＋）／％狆犳＋＝犖２１／犖２．×１００＝１００－特异性相对准确度ｃ／％（犖１１＋犖２２）／（犖１．＋犖２．）×１００注：犖：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：犖１１表示第一行，第一列；犖１．表示所有的第一行，犖．２表示所有的第二列；犖１２表示第一行，第二列。ａ样品中实际的公议值结果。ｂ赭曲霉毒素Ａ胶体金试纸条得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。ｃ为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法起草单位：山东省食品药品检验研究院。本方法验证单位：北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）、广东省食品检验所、安徽省产品质量监督检验研究院、山东食安检测技术有限公司、国家粮食和物资储备局、河南省口岸食品检验检测所。本方法主要起草人：田洪芸、张海红、王骏、毕婷婷、胡梅、任雪梅、叶金。６