医学硕士答辩欧琴答辩ppt课件

《医学硕士答辩欧琴答辩ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

EBVLMP2B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究温州医学院2004级硕士学位论文答辩答辩人：欧琴导师：张丽芳教授夏克栋教授专业：病原生物学2007.5.171.

1主要内容◆研究背景◆研究目的◆研究方案◆结果◆分析与讨论◆结论2.

2研究背景EB病毒(Epstein-Barrvirua,EBV)属于γ疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。3.

3研究背景肿瘤亚型EBV阳性率表1EBV相关的增生性疾病Burkitt淋巴瘤E-BL100%S-BL15%-85%AIDS-BL100%NPC低分化或未分化100％霍奇金病mc/ld80%-90%ns30％T细胞淋巴瘤fatalIM100%AILD40%淋巴母细胞瘤fatalIM100%与器官移植相关100％与AIDS相关70％-80%4.

4研究背景LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原之一。5.

5研究背景表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。6.

6研究背景NPC患者血清中能检测LMP2抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽抗原可用于血清学检测。7.

7研究目的1.预测EBVLMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。2.分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。3.将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。8.

8研究方案一、EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测9.

9研究方案采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列(http://www.expasy.org/sprot/);采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法预测LMP2二级结构(http://www.expasy.ch/tools)；采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域(http://www.expasy.ch/tools)；采用EXPASY服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)；对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并用吴玉章等建立的抗原性指数(AI)综合评判EBVLMP2的B细胞优势表位。◆◆◆◆◆10.

10研究方案二、EBVLMP2B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化11.

11研究方案引物设计与合成退火获得目的基因pET32a(+)/EBV-LMP2B细胞表位重组质粒的构建纯化、连接、转化DH5α大肠杆菌转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白SDS-PAGE、Westernblot分析pET32a(+)质粒酶切酶切、测序鉴定12.

12研究方案引物碱基序列酶切位点OZLF-675’TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAABamHIAGGGCGGATCTTCGATGCGG3’OZLF-685’GATCCCGCATCGAAGATCCGCCXhoICTTTAACAGCCTGCTGTAAC3’OZLF-695’TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG3’BamHIOZLF-705’GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC3’XhoIOZLF-715’TCGAGTTAATTCGGGATAAATTCBamHITGTGCTGGACAATGATTTG3’OZLF-725’GATCCAAATCATTGTCCAGCACAXhoIGAATTTATCCCGAATTAAC3’13.

13图1pET32a/B细胞表位的重组质粒图研究方案14.

14研究方案层析纯化蛋白：灌胶BufferB液调节吸光度和透光度样本处理样本加入层析柱中，收集滤液BufferB液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferD液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferE液洗涤，至A＜0.01，收集滤液样本收集SDS-PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况BufferB:8M尿素(pH8.0)BufferD:8M尿素(pH6.8)BufferE:8M尿素(pH4.0)15.

15研究方案三、EBVLMP2B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究及血清学检测16.

16研究方案动物：ICR小鼠免疫方式：背部皮下多点注射采血方式：眶静脉采血，3只/组表2动物实验设计组别数量(只)蛋白剂量(ug/只)注射时间取血时间Ⅰ9ozlf-67500、2、3W2、3、6WⅡ9ozlf-69500、2、3W2、3、6WⅢ9ozlf-71500、2、3W2、3、6WⅣ9Ｈis蛋白500、2、3W2、3、6WⅤ9PBS0、2、3W2、3、6W17.

17研究方案ELISA检测：以纯化的融合蛋白作包被抗原以B95.8细胞作包被抗原选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体18.

18结果一、EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测19.

19结果H:α-螺旋；e:β-片层；c:无规卷曲；-:未预测结构；t:β-转角图2EBVLMP2二级结构预测20.

20结果aa144～150202～208265～268318～322375～390445～455图2按SOSUI程序预测EBVLMP2蛋白跨膜区膜内区域跨膜区膜外区域21.

21结果图3各种不同参数对EBVLMP2的预测结果a.亲水性参数b.极性参数c.柔韧性参数d.表面可及性e.抗原性22.

22二级结构10～82,89～108,116～126,142～149,198～206,288～295,317～321,339～348,379～389,414～422,481～497膜外区域144～150,202～208,265～268,318～322,375～390,445～455亲水性15～26,36～41,43～60,65～74,90～96,101～119,176～179,199～205,236～242,414～416,483～492表面可及性13～18,20～22,25～32,39～64,67～82,90～92,95～112,114～116,73～178199～201,203～204,235～240,378～380,383～384,416～420,484～496抗原性10～83,88～109,111～121,174～179,198～207,235～241,290～293,340～348,380～387,413～421,471～476,483～491极性20～23,45～55,57～59,65～74,90～94,102～117,198～203,234～342,483～491柔韧性10～85,89～121,199～205,218～222,236～244,289～296,342～347,370～378,381～383,385～388,412～420,483～493预测方法预测结果结果表3应用不同方法预测EBVLMP2蛋白B细胞表位的肽段位置23.

23结果145～150TASVST0.005199～209RIEDPPFNSLL0.037318～322TLNLT0.036381～391KSLSSTEFIPN0.028B细胞表位区域氨基酸序列抗原性指数表4EBVLMP2的B细胞表位优势区域的平均抗原性指数24.

24二、EBVLMP2B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化结果25.

25结果图4重组质粒pET32a/ozlf-67酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-67;3:pET32a/ozlf-67/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI图5重组质粒pET32a/ozlf-69酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-69;3:pET32a/ozlf-69/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI图6重组质粒pET32a/ozlf-71酶切鉴定1:λDNA/HindⅢDNAMarker;2.pET32a/ozlf-71;3:pET32a/ozlf-71/EcoRI;4:pET32a(+);5:pET32a(+)/EcoRI重组质粒酶切鉴定26.

26结果测序结果图73个重组的目的基因的测序图27.

27结果B细胞表位融合蛋白鉴定图8B细胞表位融合蛋白表达产物SDS-PAGE和Western-Blot分析1:蛋白分子标准物；2:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-67蛋白表达；3:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-69蛋白表达；4:IPTG诱导重组质粒pET32a/ozlf-71蛋白表达；5:IPTG诱导重组质粒pET32a蛋白表达；6:BL2128.

28结果ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的纯化图9纯化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-7：BufferE液滤液图10纯化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-8：BufferE液滤液29.

29图11纯化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5-6：BufferE液滤液图12纯化的His蛋白SDS-PAGE电泳分析1：蛋白分子标准物；2：样品穿透液；3：BufferB液滤液；4：BufferC液滤液；5：BufferE液滤液结果30.

30结果三、EBVLMP2B细胞表位融合蛋白免疫原性的初步研究31.

31结果图13不同免疫原在不同时间的抗体均值（X±SD）32.

32分别包被3种表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分别检测3种表位融合蛋白的免疫血清与His蛋白免疫血清的抗体效价差异。结果图14多肽表位诱导鼠免疫血清的抗体效价的ELISA检测结果**：与His蛋白免疫组比较**33.

33结果B95.8细胞作为包被抗原，ELISA检测3种表位融合蛋白免疫小鼠制备的鼠血清抗体效价。图15B95.8细胞包被ELISA检测鼠免疫血清抗体效价*：与His蛋白免疫组比较***34.

34结果选用Ozlf-67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC组、CA疾病对照组及健康对照组血清特异性IgG抗体。图16ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体效价*：与正常组比较*35.

35结果分组份数A值阳性阴性阳性率NPC组480.866±0.231341370.8％CA组680.140±0.1064645.9％正常组680.184±0.0670680表5ozlf-67蛋白包被ELISA检测病人血清抗体阳性率**与正常组比较*36.

36分析与讨论预测的B细胞表位是线性B细胞表位，主要的参数有二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性、抗原性以及柔韧性等，抗原性和亲水性是形成表位的首要条件，因而优势表位的形成是多种因素综合作用的结果。37.

37分析与讨论采用分子生物学方法分别得到了包含预测表位片段的重组质粒，并得到了融合蛋白，为进一步表位融合蛋白的免疫学检测奠定基础。38.

38分析与讨论3种表位融合蛋白均具有良好的免疫原性B细胞表位多肽均能诱导产生特异性抗体以B95.8细胞作为抗原包被酶标板，B细胞表位融合蛋白诱导的小鼠免疫血清与EBV抗原特异性结合，但抗体效价较低，可能是由于单个表位肽的结合能力较弱。39.

39分析与讨论选用Ozlf67融合蛋白为诊断抗原，ELISA检测NPC患者血清特异性抗体，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。40.

40结论1.预测EBVLMP2的B细胞表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段；2.分别成功构建了含B细胞表位的重组质粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表达系统内分别高效表达了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通过亲和层析法得到了纯化的表位融合蛋白。3.表位融合蛋白免疫小鼠血清学检测，表明3个B细胞表位融合蛋白均能刺激机体产生抗体，具有较强的免疫原性，抗体效价随免疫次数增加而升高；表位融合蛋白诱导所产生的抗体均能与EBV抗原结合。4.Ozlf67蛋白作为诊断抗原，具有较强的抗原性，用于NPC的血清学诊断试剂的研制具有临床应用价值。41.

41首先我要衷心感谢我的导师张丽芳教授、夏克栋教授三年来对我的悉心指教和无私关怀。本文是在导师的悉心指导和严格要求下得以完成。在此向导师致以最诚挚的敬意和感谢！感谢基础医学院微免教研室和基础医学院实验平台全体老师给予的帮助和支持！感谢附一和附二检验科老师给予实验的帮助！感谢师姐、师弟、师妹及我的同学等对我实验的帮助及生活的关心！我要衷心感谢我的家人，他们的关心和鼓励给予我强大的精神动力。他们为我所做的无私奉献将使我终生感激！最后感谢评审委员和参与本人论文答辩的各位专家教授在百忙之中对本文的指导！致谢42.

42谢谢！43.

43后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用44.

44主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！45.

45致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求46.

46感谢您的观看和下载Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer,orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield47.