医学硕士答辩-欧琴答辩

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1、EBVLMP2B细胞表位的预测、克隆、表达及其融合蛋白免疫原性的初步研究温州医学院2004级硕士学位论文答辩答辩人：欧琴导师：张丽芳教授夏克栋教授专业：病原生物学2007.5.17主要内容◆研究背景◆研究目的◆研究方案◆结果◆分析与讨论◆结论研究背景EB病毒(Epstein-Barrvirua,EBV)属于γ疱疹病毒科。引起的主要疾病包括传染性单核细胞增多症、移植后淋巴细胞增多症(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。研究背景肿瘤亚型EBV阳性率表1EBV相关的增生性疾病Burkitt淋巴瘤E-BL100%S-BL15%-85%AIDS-BL

2、100%NPC低分化或未分化100％霍奇金病mc/ld80%-90%ns30％T细胞淋巴瘤fatalIM100%AILD40%淋巴母细胞瘤fatalIM100%与器官移植相关100％与AIDS相关70％-80%研究背景LMP2不是转化基因，维持EBV潜伏感染。LMP2成为NPC等EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原之一。研究背景表位疫苗是目前研制感染性疾病与恶性肿瘤疫苗的方向。多表位疫苗能选择性诱导多价、多特异性应答和控制免疫应答类型。研究背景NPC患者血清中能检测LMP2抗体。B细胞表位的研究为单克隆抗体的制备提供更充分的依据，以B细胞表位为基础的多肽抗原可用于血清学检测

3、。研究目的1.预测EBVLMP2的B细胞表位，可为其单克隆抗体的制备及表位疫苗设计等研究提供理论依据。2.分别构建含预测B细胞表位多肽的原核重组质粒，采用6个组氨酸标签(His.tag)表达表位融合蛋白，并用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白。3.将纯化的蛋白分别免疫小鼠，检测其诱导小鼠产生的特异性IgG抗体；选择抗原性强的融合蛋白作包被抗原，用ELISA检测NPC组、CA疾病对照组和健康对照组的血清特异性抗体。为B细胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清学诊断中的应用价值进行初步探讨。研究方案一、EBVLMP2的二级结构分析和B细胞表位预测研究方案

4、采用EXPASY服务器提供的SwissProt蛋白质数据库检索LMP2完整蛋白质的氨基酸序列(http://www.expasy.org/sprot/);采用EXPASY服务器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法预测LMP2二级结构(http://www.expasy.ch/tools)；采用EXPASY服务器提供的SOSUI方法预测LMP2跨膜区域(http://www.expasy.ch/tools)；采用EXPASY服务器提供的Hopp&Woods、Emini、Jameson-Wolf、Zimmerman方法预测LMP2的亲水性、表面可及性、

5、抗原性、极性及柔韧性参数(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)；对上述方法预测的结果进行综合分析，推断LMP2的B细胞表位，并用吴玉章等建立的抗原性指数(AI)综合评判EBVLMP2的B细胞优势表位。◆◆◆◆◆研究方案二、EBVLMP2B细胞表位的克隆、表达及其融合蛋白的纯化研究方案引物设计与合成退火获得目的基因pET32a(+)/EBV-LMP2B细胞表位重组质粒的构建纯化、连接、转化DH5α大肠杆菌转化BL21大肠杆菌，诱导、表达、纯化表位融合蛋白SDS-PAGE、Westernblot分析pET32a(+)质粒酶

6、切酶切、测序鉴定研究方案引物碱基序列酶切位点OZLF-675’TCGAGTTACAGCAGGCTGTTAABamHIAGGGCGGATCTTCGATGCGG3’OZLF-685’GATCCCGCATCGAAGATCCGCCXhoICTTTAACAGCCTGCTGTAAC3’OZLF-695’TCGAGTTAAGTGAGATTTAAGGTG3’BamHIOZLF-705’GATCCACCTTAAATCTCACTTAAC3’XhoIOZLF-715’TCGAGTTAATTCGGGATAAATTCBamHITGTGCTGGACAATGATTTG3’OZLF-725’GATC

7、CAAATCATTGTCCAGCACAXhoIGAATTTATCCCGAATTAAC3’图1pET32a/B细胞表位的重组质粒图研究方案研究方案层析纯化蛋白：灌胶BufferB液调节吸光度和透光度样本处理样本加入层析柱中，收集滤液BufferB液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferD液洗涤，至A＜0.01，收集滤液BufferE液洗涤，至A＜0.01，收集滤液样本收集SDS-PAGE分析滤液中目的蛋白分布情况BufferB:8M尿素(pH8.0)BufferD:8M尿素(pH6.8)BufferE:8M尿素(pH4.0)研究方案三、EBVLMP