细胞培养-复苏-传代换液-冻存计数(自编)

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细胞培养程序材料A、仪器1.净化工作台，2.离心机，3.恒温水浴箱，4.冰箱（4℃）5.倒置相差显微镜，6.CO2培养箱，7.振荡混合仪8.酶联免疫检测仪，9.移液枪，10.电磁力搅拌机，11.微孔滤器B、玻璃器皿1.吸管，2.小烧杯（100ml），3.废液缸，C、塑料器皿1.吸头，2.枪头，3.96孔培养板，4.15ml离心管，5.50ml离心管，6.胶塞，D、其他物品1.微量加样枪，2.红血球计数板，F、试剂1.D-Hanks液，2.小牛血清，3.RPMI1640，4.双抗（青霉素、链霉素），5.0.25%胰酶，6.0.025%EDTA7.二甲基亚砜（DMSO），8.MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1.贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2遍，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。其他方法：消化分离法、器官培养略2.悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。（二）细胞株(系)细胞复苏培养细胞复苏的主要操作步骤(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。(3)然后在无菌下取出细胞。

1冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察(一)原代细胞的维持1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。2、悬浮细胞凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。半量换液的方法如下：将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。（二）传代细胞维持培养：同上（三）培养选拔常规观察：1.培养液2.细胞生长情况3.细胞形态变化4.污染情况三、细胞的传代培养：(1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。(2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。（可以省略）(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。(4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。

2(5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。(6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。(7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3至1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*106/ml，经10倍稀释每瓶达105/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1*107）冻存。（到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）四．细胞冻存：细胞冻存液：20%小牛血清10%二甲基亚砜DMSO70%培养液或，10%二甲基亚砜DMSO90%小牛血清操作步骤：选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前一天换液。按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*107/ml左右，离心，去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5*107/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*105ml数量）。一般25cm2的培养瓶满瓶才达到105.加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成）分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。冻存：冰箱4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存，4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。附件一、培养细胞的生长状况观察（一）细胞计数操作规程胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9）使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。方法：1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513）2、取0.5ml　0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数中间和四角边长/mm的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和死细胞数。注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见sigmaP1845的图II）2）重复上述步骤计数第2个小室

3注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在10个正方形方格中细胞数少于200个或多于500个（20－50个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。3）准备第二份样品并重新计数以保证准确4）细胞计数－血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其长度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm），总体积为0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来计算。每毫升细胞数＝每个正方形的平均细胞数´稀释倍数´104（10个正方形的细胞计数）例：如果每个正方形的平均细胞数是45´5´104＝2.25´106个细胞/ml总细胞数＝每毫升细胞数´最初的细胞样品的体积例：2.25´106(个细胞/ml)´10ml（最初体积）＝2.25´107个细胞（总细胞）5）活细胞比例（%）＝总的活细胞数（没染上色的）¸总的细胞（染上色的和没染上色的）´100例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数＝(37.5´5´104)活细胞数/ml´10ml（最初体积）＝1.875´107个活细胞，活细胞比率（%）＝1.875´107（活细胞数）¸2.25´107(总细胞数)´100＝83%.血球计数板的使用16×25型的计数板将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数或：4个中格的细胞数/4×16×10000×稀释倍数有一种计数板的结构为25×16，计算如下：4个中格的细胞数/4×25×10000×稀释倍数（二）.细胞生长曲线（细胞贴壁率、细胞分裂率：略）概念：

4细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。方法：计数法：1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。3．24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。　　4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。MTT法：　　1．制备1mL细胞悬液。空白对照以1mL培养基代替细胞悬液。加入0．1mLMTT于37℃孵育4h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。　　2．加1mLDTW脱色液，37℃至少静置30min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。　　3．吸取200μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。4．每隔24h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。CCK-8法：略CCK-8法的优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、CCK-8法能快速检测；3、CK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；4、CCK-8法的重复性优于MTT法；5、CCK-8法对细胞毒性小；6、CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK-8法的缺点:1、与MTT法相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。（三）.活选细胞观察：相差倒置显微镜使用：略附件二：细胞裂解液：提取RNA用0.5%SDS0.1mmol/LEDTA(PH8.0)10mmol/LTris.cl(PH8.0)20ug/mlRNaseTE:RNA、DNA溶解用1mmol/LEDTA(PH8.0)10mmol/LTris.cl(PH8.0)附件三.IC50半抑制率实验：MTT法：MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项：MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

5　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。MTT溶液的配制方法　　通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。　　MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。　　MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。PBS配方：Nacl8g　　Kcl0.2gNa2HPO41.44g　　KH2PO40.24g　调pH7.4　　定容1LMTT法实验步骤贴壁细胞：　　1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。　　2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况　　3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。　　4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。　　5、终止培养，小心吸去孔内培养液。　　6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。　　7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）　　悬浮细胞：　　1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml1640）。　　2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。　　3、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）　　4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

6　　5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。（4）MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率：一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度.IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025有一个公式可供参考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率例：用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ulDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（AnnexinV），细胞周期的亚G0峰比较明显。培养细胞的冷冻保存与复苏nPolge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。

7n冷冻保存与复苏原理在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。•冷冻速率冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较多冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C/min、70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。•冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-1960C）是

8目前最佳的冷冻保存温度。在-1960C时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-400C范围内保存细胞的效果不佳。•复苏速率冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在370C水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。•冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在40C时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在40C下进行，一般需要40～60分钟。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。n冷冻保存方法按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-700C～-800C，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。•非玻璃化冻存方法²主要材料

9（1）仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。²操作过程1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。2.分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；(2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；(3)将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；(4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；(5)最后将冻存管投入液氮保存。3.记录做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。讨论在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～400C温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。•玻璃化冻存方法²主要材料（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr8000）而成。用2mol/LNaOH调节pH至7.4，现配现用。（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；（3）设备：液氮储存罐；（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。²冻存过程（1）用常规方法分离全血中单核细胞；（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；

10（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；（5轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；（7）将冻存管两端以火焰封口；（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为6000C/min。²冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。讨论因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在40C时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在40C冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。n冻存细胞的复苏•非玻璃化冻存的复苏方法²主要材料（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；（2）培养用液：完全培养液。²复苏过程（1）调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；（2）从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。结果复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。²讨论细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。n玻璃化冻存的复苏方法²主要材料（1）设备：高速离心机；（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。²操作过程(1)将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；(2)将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；(3)沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；(4)将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。结果复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。讨论复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C

11冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。