细胞谱系示踪技术

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生理科学进展２０１４年第４５卷第５期·３７９·倡细胞谱系示踪技术１１１１，２，△李晓刚苏楠杜晓兰陈林１（第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室，骨代谢与修复中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室；２康复理疗科，重庆４０００４２）摘要细胞谱系示踪（ｃｅｌｌｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇ）是指利用各种方式标记细胞，并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自２０世纪以来，谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年，随着基因工程技术的飞速发展，细胞谱系示踪技术也有所突破，尤其是诱导性重组酶Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统的应用，极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围。本文将结合细胞谱系示踪技术在多种研究中的应用，对该技术的原理、特点以及最新进展做一综述。关键词谱系示踪；基因打靶；活体示踪中图分类号Ｑ３３；Ｒ３９４１１１１，２，△１CellLineageTracingＬＩＸｉａｏ-Ｇａｎｇ，ＳＵＮａｎ，ＤＵＸｉａｏ-Ｌａｎ，ＣＨＥＮＬｉｎ（StateKeyLaboratoryofTrauma，BurnsandCombinedInjury，CenterofBoneMetabolismandRepair，InstituteofSurgeryRe-２search；DepartmentofRehabilitationMedcine，DapingHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００４２，Ｃｈｉｎａ）AbstractＣｅｌｌｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇｉｓｔｏｔｒａｃｋｃｅｒｔａｉｎｃｅｌｌａｎｄａｌｌｏｆｉｔｓｐｒｏｇｅｎｙ．Ｆｒｏｍｔｈｅ２０ｔｈｃｅｎｔｕｒｙ，ｌｉｎｅ-ａｇｅｔｒａｃｉｎｇｈａｓｐｒｏｖｉｄｅｄａｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｓｔｕｄｙｏｒｇａｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒｉａｅｄｃｅｌｌｆａｔｅ-ｄｅ-ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｒｅｃｅｎｔｌｙ，ｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｔｈｅａｐｐｌｉｃａ-ｔｉｏｎｏｆＣｒｅ／ｌｏｘｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍｅｘｐａｎｄｓｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｎｇｅｏｆｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇ．Ｈｅｒｅｗｅｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓ，ａｎｄｓｕｍｍａｒｉｚｅｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｒｅ-ｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Keywordsｌｉｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇ；ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ；ｉｎｖｉｖｏｃｅｌｌｔｒａｃｋｉｎｇ多细胞生物的生长发育基于细胞分裂和分化。程，其根本是发育问题。但细胞示踪是一个较笼统在哺乳动物的胚胎发育早期阶段，每个细胞就已经的概念，指标记和追踪细胞。被赋予了特定的分化潜能（ｃｅｌｌｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ），这种特对于细胞示踪技术的探索起源于２０世纪初，早性在后期发育过程中才逐渐表现出来，最终分成为在１９０５年，Ｃｏｎｋｌｉｎ等利用了海鞘胚胎早期分裂球不同的组织、器官类型。另外一方面，某些终末分化着色差异的特性，对分裂球的分裂过程进行观察，的成体细胞在一定的生理或者病理条件下会发生去Ｗｅｔｗｅｌ等则应用了慢速摄影（ｔｉｍｅ-ｌａｐｓｅｃｉｎｅｍａｔｏｇ-分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）或者转分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ-ｒａｐｈｙ）技术拍摄活体胚胎的发育。此后，研究者尝ｔｉｏｎ），变为另外一种细胞或组织类型，例如肿瘤的试利用水溶性染料、脂溶性染料、过氧化物酶以及荧［１］发生、心脏成纤维细胞再编程转分化为心肌细胞光染料等，通过物理的方式注入到细胞内对其进行等现象。细胞的命运决定是指单个细胞及其所有后标记追踪，尽管这些技术手段解决了当时的一些问代细胞的分化和发育活动，对细胞的命运决定进行追踪和观察称为细胞谱系示踪。细胞谱系示踪和广倡国家重大科学计划（９７３）（２０１４ＣＢ９４２９０４），国家自然科学义上的细胞示踪（ｃｅｌｌｔｒａｃｋｉｎｇ）有本质区别，细胞谱基金项目（８１２７００１２，８１１７０８０９）资助课题△系示踪所要研究的问题是一种细胞的命运改变过通讯作者

1·３８０·生理科学进展２０１４年第４５卷第５期题，然而在现在看来还存在许多缺陷。首先通过物较高能量激发光激发时发生构象改变而引起。理的方法无法保证精准地标记目标细胞；其次，在细荧光蛋白由于荧光信号强，便于观察追踪，现已胞的分裂过程中标记染料会被逐渐稀释直至消失，广泛应用示踪研究中，其中最常用的荧光蛋白为绿传统的标记手段也无法有效的对单个细胞及其后代色荧光蛋白，尽管其荧光强度较红色荧光蛋白稍弱，细胞进行永久的标记。但它对细胞毒性最小。另外，串联型二聚体ｔｄＴｏｍａ-随着基因工程技术的成熟，利用基因打靶技术ｔｏ也是一种常用的荧光蛋白，它是红色荧光蛋白的的细胞谱系示踪逐渐发展起来。首先，在示踪标记变异体，具有强于绿色荧光蛋白的荧光强度，并且能物的应用方面，内源性遗传标记物取代外源性标记很快降解成单体减少对细胞毒性作用。然而，荧光物，该类标记发生于基因水平，能够克服传统标记物蛋白的局限在于荧光发光必须依赖于激发光，因此的局限和缺点；其次，在标记的方式上也有很大突荧光信号极易受到周围组织干扰。最近Ｓａｉｔｏ等人［４］破，由“宏观”的物理标记法逐渐转变为“微观”的基研究了一种新型自主发光蛋白Ｎａｎｏ-ｌａｎｔｅｒｎ，这种因打靶标记，这从根本上解决了物理标记过程造成新型蛋白是由海肾荧光素酶和一种具有高效生物发细胞损伤以及随着传代标记会被稀释的问题；最后，光共振能量转移性的荧光蛋白融合而成，它能够在在追踪手段上，通过借助光学显微镜，可在活体内对活动小鼠体内显示清晰地显示荧光信号，以观察体细胞进行追踪和观察。内单细胞、或者特定组织器官的生理活动情况。除一、细胞示踪标记方法及应用此之外，利用Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ位点特异性重组系统构建的［５］（一）遗传性标记物遗传性标记物是指由基双荧光mT／mG小鼠也基于荧光蛋白的特性，它因编码的可以稳定遗传的，并且其本身具有易识别能够在Ｃｒｅ的作用下改变荧光颜色，从而提高了细性的标志分子。除此之外，还具备无毒性、不影响细胞在组织内分辨率。胞本身代谢和结构的优势。３．β-半乳糖苷酶（β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，β-ｇａｌ）：β-半１．荧光素酶：将荧光素酶基因整合入细胞，表达乳糖苷酶是ＬａｃＺ基因的表达产物，已广泛应用于基荧光素酶，通过控制底物，可以观察到被标记细胞发因表达调控研究。β-半乳糖苷酶可催化乳糖水解，光现象，波长范围在５００～７００ｎｍ，其发光本质为酶用Ｘ-Ｇａｌ为底物进行染色时呈蓝色，这一特性使其催化底物的化学发光反应。目前常用的荧光素酶有易于观察和检测。但是它最大的缺点为不能在活体北美萤火虫萤光素酶（Ｎｏｒｔｈａｍｅｒｉｃａｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒ-内观察。［２］ａｓｅ）和海肾萤光素酶（ｒｅｎｉｌｌａｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ），荧光波综上所述，遗传性标记物与以往传统的细胞标长分别为５４０～６００ｎｍ和４６０～５４０ｎｍ。由荧光素酶记物最大的区别在于它不会向临近细胞污染扩散，催化底物发光的方式不需要激发光，光能来源于酶能够稳定的表达，并且随着细胞的分裂，标记也会遗催化反应，因此发光只发生在活体细胞内，它很大程传给子代细胞。在研究中，除上述三种最常见遗传度上避免了激发光造成的光噪现象。这种发光方式标记物之外，还有很多其他类型遗传标记物，例如碱［６，７］具有一定的组织穿透性，Ｙｉ等在体外利用携带荧光性磷酸酶、ｃ-ｍｙｃ等。然而，不同的遗传性标记素酶基因的质粒转染神经祖细胞，之后移植到裸鼠物都有其各自的特点，应根据研究目的选择合适的大脑内，通过应用荧光素酶底物结合成像设备观标记物，另外还需考虑标记物对细胞本身的影响，研［３］察到神经祖细胞向胶质瘤的迁移活动。然而，究的组织类型以及实验动物等因素。荧光素酶的缺点是其催化发光极易淬灭，同时底（二）标记方式物也具有免疫原性，并且不适用于固定的标本中１．转染和转导技术的应用：转染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）发光。指真核细胞由于外源ＤＮＡ掺入而获得新的遗传标２．荧光蛋白：最早的荧光蛋白由Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ等志的过程。外源基因进入细胞主要有四种方法，包（１９６２）在Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ水母体内发现，随后相继括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法以及病毒介导发现了３０多种波长不同的荧光蛋白，包括绿色荧光法。Ｈｏｌｔ等（１９９０）利用脂质体将荧光素酶ｃＤＮＡ转蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白及橙色荧光蛋白染到爪蟾胚胎的脑神经元中，观察视网膜发育过程等。与荧光素酶催化底物发光的方式不同，荧光蛋中神经元分化命运。Ｉｔａｓａｋｉ等（１９９９）则运用电转的白不需要注射底物，发光的原理是自身蛋白构象在方式将外源标志基因转入禽类胚胎中。尽管目前转

2生理科学进展２０１４年第４５卷第５期·３８１·染技术越来越成熟，但由于转染对细胞伤害性较大，上更高。Ｃｒｅ重组酶由Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ等在Ｐ１噬菌体中会影响细胞正常的生长发育，加之遗传标记在细胞发现，是一种特异性重组酶，能够介导由３４ｂｐ的内表达效率及稳定性等问题，导致该种方式应用“Ｌｏｘｐ”铆定的基因序列特异性重组，完成对同向较少。“Ｌｏｘｐ”序列所铆定基因片段的切除以及对向［１１，１２］运用病毒转导（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）是将外源基因整合“Ｌｏｘｐ”铆钉基因的倒位。入目的细胞的另外一种方式。这种源于细菌遗传学Ｊｏｙｎｅｒ等人最早将Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ系统应用于体内［１３，１４］的研究手段已经应用于哺乳动物的细胞示踪。Ｌｅ-细胞谱系示踪研究。他们在研究大脑发育过ｍｉｓｃｈｋａ等在体外利用逆转录病毒将ｃ-ｍｙｃ基因转程中构建了两种转基因小鼠，一种是在β-ａｃｔｉｎ基因导入小鼠造血干细胞，然后将其注射给受大剂量射的启动子后插入标志基因ＬａｃＺ，该标志基因的表达线辐照的小鼠，进而追踪被标记的外源造血干细胞被一段由同向“Ｌｏｘｐ”铆钉的“ＳＴＯＰ”序列所干扰，［７］在体内的活动情况。然而这种传统的逆转录病另外一种小鼠则是在Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ２（Ｅｎ２）启动子后插毒转导方式只能是在体外进行操作。入Ｃｒｅ基因。当这两种转基因品系的小鼠杂交后，ＲＣＡＳ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ-ｃｏｍｐｅｔｅｎｔａｖｉａｎｓａｒｃｏｍａ-ｌｅｕ-表达Ｅｎ２的细胞会产生Ｃｒｅ酶，进而切除“ＳＴＯＰ”序ｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔｗｉｔｈｓｐｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏｒ）系列，标志基因ＬａｃＺ就能成功表达。利用该方法，统可以在体内指定时间和特定部位控制逆转录病毒Ｊｏｙｎｅｒ等人证实了Ｅｎ２阳性的细胞在小鼠中脑发育［１５］将外源基因转导入细胞内，它的主要原理为Ｒｏｕｓ中的重要作用。此后，Ｓｏｒｉａｎｏ等构建了在ＲＯ-ｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓＡ（ＲＳＶ-Ａ）病毒只能感染表达禽类ＳＡ２６位点插入ＬａｃＺ报告基因的基因定点敲入小ＴＶＡ受体的细胞，通过控制病毒感染时间和应用组鼠，该小鼠基于ＲＯＳＡβｇｅｏ２６基因捕获（Ｇｅｎｅ-ｔｒａｐ）［８～１０］［１６］织特异性表达ＴＶＡ受体的小鼠品系，能够实现小鼠品系，定点敲入的ＬａｃＺ基因上游插入被同对转导时空特异性控制。目前，ＲＣＡＳ系统已经成向“Ｌｏｘｐ”位点铆钉“ＳＴＯＰ”序列，从而指示Ｃｒｅ表熟应用于细胞示踪研究，Ｄｏｅｔｓｃｈ等利用ＲＣＡＳ系统达。该小鼠与转基因小鼠相比，敲入基因表达效率将碱性磷酸酶ＡＬＰ整合入小鼠大脑室下带星形胶更高，并且不会干扰其他基因的正常表达。质细胞内作为标记，发现室下带星形胶质细胞在正与以往的细胞示踪手段相比，Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统的［６］常条件和损伤修复时均有神经干细胞的特性。标记方式具有良好的靶向性，只会在表达组织特异与转染质粒相比，逆转录病毒感染对细胞毒性小，但性启动子的细胞内发生，很大程度上避免了错误标是它主要的问题是只能标记有分裂能力的细胞，另记的问题。此外，Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统最大的优点是对基外一方面，逆转录病毒载体也会发生表达沉默的现因组进行了修饰，具有遗传特征，发育过程中表达过象，且实验操作难度较大。Ｃｒｅ的细胞以及其后代所有的细胞都会被永久地标２．转基因与基因打靶技术的应用：基因打靶技记。然而，这一特点也导致无法对标记时间进行术是建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术上的一控制。种定向改变活体生物遗传信息的实验手段，它能使为了解决标记时间特异性的问题，Ｍｅｔｚｇｅｒ等在［１７］修饰后的遗传信息在生物活体内遗传并且稳定表Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ基础上制作了一种新的小鼠模型，这种达。自上世纪８０年代第一例基因剔除小鼠产生以模型利用了雌激素受体为核受体的性质，借此调控来，基因打靶技术发展迅速，给生命科学领域研究带Ｃｒｅ入核的时间。该模型中的Ｃｒｅ与经修饰的人类来革命性的变化。雌激素受体配体结合域融合在一起表达（Ｃｒｅ-Ｔ细胞谱系示踪技术需要体内对特定的组织、细ＥＲ），该受体不结合雌二醇，对他莫昔芬（ｔａｍｏｘ-胞类型在特定的时间段进行标记，而基因打靶技术ｉｆｅｎ）有亲和性。在没有他莫西芬的状况下，由于雌中的位点特异性重组酶（ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ，激素受体停留在细胞质中，导致Ｃｒｅ也无法进入细ＳＳＲ）系统可以满足这种需求。ＳＳＲ主要有两个成胞核，只有在外源性他莫西芬的条件下，Ｃｒｅ才能伴员：来自埃希氏大肠杆菌噬菌体Ｐ１的Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ重随雌激素受体进入细胞核，实现对Ｌｏｘｐ片段的重组组酶系统和来自酵母的ＦＬＰ／ＦＲＴ系统。两种系统修饰。因此，只要控制他莫西芬的注射时间就能实原理相似，都是在特异性位点切割和连接ＤＮＡ，然现对敲除事件进行时间上的控制（图１Ａ）。Ｂａｒｋｅｒ［１８，１９］而两种系统相比以Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ重组酶系统重组效率等利用Ｌｇｒ５-ＥＧＦＰ-ｃｒｅＥＲＴ２基因敲入小鼠和

3·３８２·生理科学进展２０１４年第４５卷第５期ＲＯＳＡ２６-ＬａｃＺ小鼠交配后（图１Ｂ），在一定的时间段ＬｏｘＰ-ＳＴＯＰ-ＬｏｘＰ-ＥＹＦＰ报告小鼠交配后追踪神经胶内注射他莫西芬，使在该时间段表达ｌｇｒ５的细胞被质祖细胞。这种方法很大程度避免了Ｃｒｅ在目的细ＬａｃＺ永久标记。通过观察被标记细胞的活动情况，胞之外的组织表达的问题，但是目前应用还比较少，发现在６０天内表达ＬａｃＺ的细胞会逐渐分化为各种有待进一步地研究。类型的肠道上皮细胞，证明了Ｌｇｒ５基因特异性地在肠道上皮干细胞中表达，提示其为肠道干细胞的标志基因。图2Ｓｐｌｉｔ-Ｃｒｅ示意图（修改自Ｈｉｒｒｌｉｎｇｅｒ等，ＰＬｏＳＯｎｅ，２００９，４瞷ｅ４２８６）３．复合式标记：相比单一标记的基因报告小鼠，复合式标记方式能更好地指示目的细胞的位置。最早的复合式标记小鼠包括Ｚ／ＡＰ和Ｚ／ＥＧ，两者都是基于Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统建立的。Ｚ／ＡＰ小鼠中由于“Ｌｏｘｐ”铆钉的βｇｅｏ基因干扰其后的ＡＬＰ表达，因此在表达活性Ｃｒｅ之前所有细胞呈ＬａｃＺ染色阳性，而经重组修饰后β半乳糖苷酶停止表达，目的细胞［２１］转变为表达ＡＬＰ。Ｚ／ＡＰ小鼠的局限在于阳性细胞不能用于流式细胞检测，并且两种标记方式都只能通过切片染色方式观察。原理与Ｚ／ＡＰ小鼠相［２２］似，Ｚ／ＥＧ小鼠是由ＬａｃＺ与ＥＧＦＰ组成，它的优点在于能够在活体组织中观察ＥＧＦＰ荧光，因此更［５］容易追踪被标记的细胞。双荧光蛋白mT／mG小鼠是另外一种复合式标记小鼠，在Ｃｒｅ介导重组修饰后，mT／mG小鼠由表达ｔｄＴｏｍａｔｏ转变为ＥＧＦＰＴ图1Ｃｒｅ-ＥＲ原理及应用（图３）。除此之外，该小鼠所表达的ｔｄＴｏｍａｔｏ及（修改自Ｂａｒｋｅｒ等．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４９瞷１００３～１００７）ＥＧＦＰ都具有细胞膜靶向性，因此，该小鼠能在激发光条件下以不同于未标记细胞的荧光颜色显示被标综上所述，Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统已经成为条件性基因记细胞，极大地提高了观察分辨率。Ｂｏｗｍａｎ等利调控的较理想工具，并且已经成熟地应用于细胞示用Ｒｏｓａ２６-ｍＴ／ｍＧ小鼠与Ａｘｉｎ２ＣｒｅＥＲＴ２小鼠证明踪研究。然而，并不是所有的启动子都能特异性地了Ｗｎｔ／β-ｃａｔｅｎｉｎ信号通路在整个发育过程中对神表达于单一类型的细胞，示踪研究中用来驱动Ｃｒｅ［２３］经干细胞功能及稳态的重要作用。多荧光标记表达的启动子往往会同时表达于多种细胞或者组织［２４］系统“Ｂｒａｉｎｂｏｗ”是应用于斑马鱼的复合式标记类型，这样就不利于研究特定细胞的活动。Ｈｉｒ-系统，它能使体内不同细胞显示不同颜色的荧光信［２０］ｒｌｉｎｇｅｒ等设计了“Ｓｐｌｉｔ-ｃｒｅ”系统，在这种系统中号，Ｐａｎ等发现在“Ｂｒａｉｎｂｏｗ”系统内各种细胞由于Ｃｒｅ被分做Ｃ端和Ｎ端两部分，两者分别由两种不不同荧光蛋白叠加所产生的多种荧光颜色可以随着同的启动子驱动表达，当两者同时出现在同一种细细胞传代而稳定遗传。胞时，才会形成有功能的Ｃｒｅ（图２）。以此为基础，综上所述，复合式标记系统极大地提高了被标研究者利用神经胶质原纤维酸性蛋白（gfap）和髓鞘记细胞的辨识度，尤其是结合于影像学技术，例如单蛋白脂蛋白１（plp１）启动子分别驱动Ｃｒｅ酶的Ｃ端光子显微镜、双光子显微镜及ＩＶＩＳ等设备时可以满和Ｎ端表达，通过构建转基因小鼠，与ＲＯＳＡ２６-足活体细胞示踪的需要。

4生理科学进展２０１４年第４５卷第５期·３８３·有组织穿透力强、荧光信噪比高以及光毒性小等优［２８］点。在最初阶段，双光子显微镜的应用主要集中于斑马鱼等体型较小、透光性好的动物中。另外对于观察的组织类型，其在软组织中成像效果明显优于骨骼等硬组织，这主要是因为双光子显微镜穿透深度的限制。随着技术设备的提高，双光子显微镜已经能够用于哺乳动物硬组织的研究。最近，Ｋｉｋｕ-ｔａ等人通过将ＧＦＰ定点基因敲入作为破骨细胞特异性内源性标记物，之后利用双光子显微镜直观地观察了活体小鼠颅骨骨髓腔中ＲＡＮＫＬ以及Ｔｈ１７［２９］细胞对破骨细胞的调控作用，为“骨骼动态组织图3mT／mG复合式标记系统［３０］学”研究奠定了一定的基础。综上所述，双光子（修改自Ｍｕｚｕｍｄａｒ等，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００７，４５瞷５９３～６０５）显微镜系统更着重于精确地显示局部单个或者极少数细胞细微的活动状态，而不能显示细胞在整体水（三）内源性标记的活体示踪内源性标记的平大范围的活动情况。活体示踪相比外源性标记示踪更能阐明细胞在体内二、结语与展望真实的分化发育及迁移情况。近些年来，分子影像细胞谱系示踪所关注的问题是细胞及其所有后学（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇ）的发展为活体细胞示踪开辟代细胞分化发育的最终命运及迁移活动。在研究对了新的途径。利用内源性遗传标记物的光学特性结象上，细胞谱系示踪早期大多以低等动物例如海鞘、合分子影像学技术手段可以实现对目的细胞在活体果蝇，斑马鱼等为主，但随着技术的进步研究逐渐向内进行可视化实时性追踪。ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ成像系统哺乳动物之类的高等动物转变；在研究方法上，基因和双光子显微镜（ｔｗｏ-ｐｈｏｔｏｎｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）打靶技术已成为细胞谱系示踪技术有力的工具，尤是近些年发展的应用于小动物活体示踪研究的成像其是各种基因工程小鼠为细胞谱系示踪研究提供了系统。良好模型，另外ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统也有望应用于细ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ成像系统可用于小动物长期观胞谱系示踪研究。然而，在观测手段上目前大多数测，具有功能性光学成像和结构性ＣＴ成像功能。的细胞谱系示踪局限于传统的组织形态学技术，不它能够检测动物体内生物发光及荧光，结合ＣＴ扫能观察细胞在活体内真实的活动情况。因此，借助描，最终以３Ｄ图形的方式显示目的细胞在体内活于先进光学设备的活体细胞谱系示踪体现了极大的动状态。ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ系统最早常应用于肿瘤发优势，它允许在活体内连续地对标记细胞进行实时［２５，２６］生、发展及治疗的研究，通常的实验方法是在追踪观察。体外利用荧光素酶标记肿瘤细胞系，再移植入裸鼠综上所述，细胞谱系示踪技术为探究正常发育、体内，利用ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ系统观察肿瘤细胞的活疾病发生及损伤修复过程中细胞的来源问题提供了动。与荧光素酶相比，大多数荧光蛋白光波长都低更加直观有力的研究方法和科学的研究手段，尤其于６００ｎｍ，位于３５０ｎｍ～５５０ｎｍ之间，因此极易被组是借助于双光子显微镜等先进光学设备的活体细胞织吸收，不利于ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ系统检测。Ｋａｔｕｓｈ-谱系示踪，结合单细胞基因组学等领域将有望开启［２７］ｋａ是一种远红光荧光蛋白，其荧光波长大于发育生物学及疾病机制研究的新篇章。６００ｎｍ，当利用Ｃｒｅ／ｌｏｘｐ系统将Ｋａｔｕｓｈｋａ作为目的细胞内源性标记时，可以利用ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ系统进参考文献行活体检测。ＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ成像系统适用于小动物整体水平的示踪研究，能较好地显示目的细胞在体１ＱｉａｎＬ，ＨｕａｎｇＹ，ＳｐｅｎｃｅｒＣＩ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｏｆ内所处的解剖位置。然而，它对于单个细胞具体的ｍｕｒｉｎｅｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｔｏｉｎｄｕｃｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｎａ-活动状态不能精确显示，例如细胞的形态、数量与运ｔｕｒｅ，２０１２，４８５瞷５９３～５９８．动等。２ＭｃＣａｆｆｒｅｙＡ，ＫａｙＭＡ，ＣｏｎｔａｇＣＨ．Ａｄｖａｎｃｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒ双光子激发显微镜与普通激光显微镜相比，具ｔｈｅｒａｐｉｅｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍａｇｉｎｇ．ＭｏｌＩｍａ-

5·３８４·生理科学进展２０１４年第４５卷第５期ｇｉｎｇ，２００３，２瞷７５～８６．ＳｃｉＵＳＡ，１９９７，９４瞷３７８９～３７９４．３ＴａｎｇＹ，ＳｈａｈＫ，ＭｅｓｓｅｒｌｉＳＭ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｔｒａｃｋｉｎｇｏｆ１７ＭｅｔｚｇｅｒＤ，ＣｈａｍｂｏｎＰ．Ｓｉｔｅ-ａｎｄｔｉｍｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｔａｒｇｅ-ｎｅｕｒａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．ＨｕｍＧｅｎｅｔｉｎｇｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２４瞷７１～８０．Ｔｈｅｒ，２００３，１４瞷１２４７～１２５４．１８ＢａｒｋｅｒＮ，ＨｕｃｈＭ，ＫｕｊａｌａＰ，ｅｔａｌ．Ｌｇｒ５（＋ｖｅ）ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ４ＳａｉｔｏＫ，ＣｈａｎｇＹＦ，ＨｏｒｉｋａｗａＫ，ｅｔａｌ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｐｒｏ-ｄｒｉｖｅｓｅｌｆ-ｒｅｎｅｗａｌｉｎｔｈｅｓｔｏｍａｃｈａｎｄｂｕｉｌｄｌｏｎｇ-ｌｉｖｅｄｇａｓ-ｔｅｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ-ｓｐｅｅｄｓｉｎｇｌｅ-ｃｅｌｌａｎｄｗｈｏｌｅ-ｂｏｄｙｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｔｒｉｃｕｎｉｔｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ，２０１０，６瞷２５～３６．Ｃｏｍｍｕｎ，２０１２，３瞷１２６２．１９ＢａｒｋｅｒＮ，ｖａｎＥｓＪＨ，ＫｕｉｐｅｒｓＪ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５ＭｕｚｕｍｄａｒＭＤ，ＴａｓｉｃＢ，ＭｉｙａｍｉｃｈｉＫ，ｅｔａｌ．Ａｇｌｏｂａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｃｏｌｏｎｂｙｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｄｏｕｂｌｅ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＣｒｅｒｅｐｏｒｔｅｒｍｏｕｓｅ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００７，４５瞷Ｌｇｒ５．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４９瞷１００３～１００７．５９３～６０５．２０ＨｉｒｒｌｉｎｇｅｒＪ，ＳｃｈｅｌｌｅｒＡ，ＨｉｒｒｌｉｎｇｅｒＰＧ，ｅｔａｌ．Ｓｐｌｉｔ-ｃｒｅ６ＤｏｅｔｓｃｈＦ，ＣａｉｌｌｅＩ，ＬｉｍＤＡ，ｅｔａｌ．Ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅａｓ-ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｃａｔｅｓｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｏｃｙｔｅｓａｒｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅａｄｕｌｔｍａｍｍａｌｉａｎｂｒａｉｎ．ｇｅｎｅｓｉｎｖｉｖｏ．ＰＬｏＳＯｎｅ，２００９，４瞷４２８６．Ｃｅｌｌ，１９９９，９７瞷７０３～７１６．２１ＬｏｂｅＣＧ，ＫｏｏｐＫＥ，ＫｒｅｐｐｎｅｒＷ，ｅｔａｌ．Ｚ／ＡＰ，ａｄｏｕｂｌｅ７ＬｅｍｉｓｃｈｋａＩＲ，ＲａｕｌｅｔＤＨ，ＭｕｌｌｉｇａｎＲＣ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｏ-ｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｃｒｅ-ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．ＤｅｖＢｉｏｌ，１９９９，ｔｅｎｔｉａｌａｎｄｄｙｎａｍｉｃｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２０８瞷２８１～２９２．Ｃｅｌｌ，１９８６，４５瞷９１７～９２７．２２ＮｏｖａｋＡ，ＧｕｏＣ，ＹａｎｇＷ，ｅｔａｌ．Ｚ／ＥＧ，ａｄｏｕｂｌｅｒｅｐｏｒｔｅｒ８ＨｕｇｈｅｓＳＨ，ＧｒｅｅｎｈｏｕｓｅＪＪ，ＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓＣＪ，ｅｔａｌ．Ａｄａｐｔｏｒｍｏｕｓｅｌｉｎｅｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｅｓｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏ-ｐｌａｓｍｉｄｓｓｉｍｐｌｉｆｙｔｈｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆｆｏｒｅｉｇｎＤＮＡｉｎｔｏｈｅｌｐｅｒ-ｔｅｉｎｕｐｏｎＣｒｅ-ｍｅｄｉａｔｅｄｅｘｃｉｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００，２８瞷ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．ＪＶｉｒｏｌ，１９８７，６１瞷３００４～１４７～１５５．３０１２．２３ＢｏｗｍａｎＡＮ，ｖａｎＡｍｅｒｏｎｇｅｎＲ，ＰａｌｍｅｒＴＤ，ｅｔａｌ．Ｌｉｎｅ-９ＶｏｎＷｅｒｄｅｒＡ，ＳｅｉｄｌｅｒＢ，ＳｃｈｍｉｄＲＭ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｇｅｔｒａｃｉｎｇｗｉｔｈＡｘｉｎ２ｒｅｖｅａｌｓｄｉｓｔｉｎｃｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄａ-ａｖｉａｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｔｉｓｓｕｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｏｍａｔｉｃｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｇｅｎｅｄｕｌｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＷｎｔ／ｂｅｔａ-ｃａｔｅｎｉｎ-ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｕｒａｌｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｔｈｅＲＣＡＳ／ＴＶＡｓｙｓｔｅｍ．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ，ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１３，１１０瞷７３２４～２０１２，７瞷１１６７～１１８３．７３２９．１０ＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓＣＪ，ＨｕｇｈｅｓＳＨ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ-ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｒｅｔｒｏ-２４ＬｉｖｅｔＪ，ＷｅｉｓｓｍａｎＴＡ，ＫａｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｆｏｒｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｃａｓ-ｆｏｒｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｓｅｔｔｅｓｉｎａｖｉａｎｃｅｌｌｓ．ＪＶｉｒｏｌ，１９９１，６５瞷３７２８～３７３７．ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０瞷５６～６２．１１ＳｔｅｒｎｂｅｒｇＮ，ＨａｍｉｌｔｏｎＤ．ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰ１ｓｉｔｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅ-２５ＫｉｍＪＢ，ＵｒｂａｎＫ，ＣｏｃｈｒａｎＥ，ｅｔａｌ．Ｎｏｎ-ｉｎｖａｓｉｖｅｄｅｔｅｃ-ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｉ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌｏｘＰｓｉｔｅｓ．ＪＭｏｌｔｉｏｎｏｆａｓｍａｌｌｎｕｍｂｅｒｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉ-Ｂｉｏｌ，１９８１，１５０瞷４６７～４８６．ｖｏ．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１０，５瞷９３６４．１２ＮａｇｙＡ．Ｃｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ：ｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓａｌｒｅａｇｅｎｔｆｏｒｇｅｎｏｍｅ２６ＬｉｍＥ，ＭｏｄｉＫＤ，ＫｉｍＪ．Ｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｉｍａｇｉｎｇｏｆｔａｉｌｏｒｉｎｇ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０００，２６瞷９９～１０９．ｍａｍｍａｒｙｔｕｍｏｒｓｕｓｉｎｇＩＶＩＳｓｐｅｃｔｒｕｍ．ＪＶｉｓＥｘｐ，２００９，１３ＳｏｎｇＤＬ，ＣｈａｌｅｐａｋｉｓＧ，ＧｒｕｓｓＰ，ｅｔａｌ．ＴｗｏＰａｘ-ｂｉｎｄｉｎｇＡｐｒ２９；（２６）．ｐｉｉ：１２１０．ｄｏｉ：１０．３７９１／１２１０．ｓｉｔｅｓａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃｂｒａｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎ２７Ｄｉｅｇｕｅｚ-ＨｕｒｔａｄｏＲ，ＭａｒｔｉｎＪ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ-ＣｏｒｒａｌＩ，ｅｔａｌ．ＡＥｎｇｒａｉｌｅｄ-２ｔｒａｎｓｇｅｎｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９６，１２２瞷６２７～Ｃｒｅ-ｒｅｐｏｒｔｅｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｆａｒ-ｒｅｄｆｌｕｏ-６３５．ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎＫａｔｕｓｈｋａ．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０１１，４９瞷３６～４５．１４ＺｉｎｙｋＤＬ，ＭｅｒｃｅｒＥＨ，ＨａｒｒｉｓＥ，ｅｔａｌ．Ｆａｔｅｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅ２８ＢｅｗｅｒｓｄｏｒｆＪ，ＰｉｃｋＲ，ＨｅｌｌＳＷ．Ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎｍｉ-ｍｏｕｓｅｍｉｄｂｒａｉｎ-ｈｉｎｄｂｒａｉｎｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｓｉｔｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＯｐｔＬｅｔｔ，１９９８，２３瞷６５５～６５７．ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，１９９８，８瞷６６５～６６８．２９ＫｉｋｕｔａＪ，ＷａｄａＹ，ＫｏｗａｄａＴ，ｅｔａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｖｉｓｕａｌｉｚａ-１５ＳｏｒｉａｎｏＰ．ＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄｌａｃＺｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅＲＯＳＡ２６ｔｉｏｎｏｆＲＡＮＫＬａｎｄＴｈ１７-ｍｅｄｉａｔｅｄｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＣｒｅｒｅｐｏｒｔｅｒｓｔｒａｉｎ．ＮａｔＧｅｎｅｔ，１９９９，２１瞷７０～７１．ＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２０１３，１２３瞷８６６～８７３．１６ＺａｍｂｒｏｗｉｃｚＢＰ，ＩｍａｍｏｔｏＡ，ＦｉｅｒｉｎｇＳ，ｅｔａｌ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆ３０ＩｓｈｉｉＭ，ＦｕｊｉｍｏｒｉＳ，ＫａｎｅｋｏＴ，ｅｔａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｌｉｖｅｉｍａ-ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｔｈｅＲＯＳＡｂｅｔａｇｅｏ２６ｇｅｎｅｔｒａｐｇｉｎｇｏｆｂｏｎｅ：ｏｐｅｎｉｎｇａｎｅｗｅｒａｗｉｔｈ＇ｂｏｎｅｈｉｓｔｏｄｙｎａｍｅｔｒｙ＇．ｓｔｒａｉｎｌｅａｄｓｔｏｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅＪＢｏｎｅＭｉｎｅｒＭｅｔａｂ，２０１３，３１瞷５０７～５１１．ｉｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ

6细胞谱系示踪技术作者：李晓刚，苏楠，杜晓兰，陈林，LIXiao-Gang，SUNan，DUXiao-Lan，CHENLin作者单位：李晓刚,苏楠,杜晓兰,LIXiao-Gang,SUNan,DUXiao-Lan(第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室，骨代谢与修复中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室)，陈林,CHENLin(第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤实验室，骨代谢与修复中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;第三军医大学大坪医院康复理疗科，重庆400042)刊名：生理科学进展英文刊名：ProgressinPhysiologicalSciences年，卷(期)：2014(5)参考文献(30条)1.QianL;HuangY;SpencerCIInvivoreprogrammingofmurinecardiacfibroblastsintoinducedcardiomyocytes20122.McCaffreyA;KayMA;ContagCHAdvancingmoleculartherapiesthroughinvivobioluminescentimaging20033.TangY;ShahK;MesserliSMInvivotrackingofneuralprogenitorcellmigrationtoglioblastomas20034.SaitoK;ChangYF;HorikawaKLuminescentpro-teinsforhigh-speedsingle-cellandwhole-bodyimaging20125.MuzumdarMD;TasicB;MiyamichiKAglobaldouble-fluorescentCrereportermouse20076.DoetschF;CailleI;LimDASubventricularzoneas-trocytesareneuralstemcellsintheadultmammalianbrain19997.LemischkaIR;RauletDH;MulliganRCDevelopmentalpo-tentialanddynamicbehaviorofhematopoieticstemcells19868.HughesSH;GreenhouseJJ;PetropoulosCJAdaptorplasmidssimplifytheinsertionofforeignDNAintohelper-independentretroviralvectors19879.VonWerderA;SeidlerB;SchmidRMProductionofavianretrovirusesandtissue-specificsomaticretroviralgenetransferinvivousingtheRCAS/TVAsystem201210.PetropoulosCJ;HughesSHReplication-competentretro-virusvectorsforthetransferandexpressionofgenecas-settesinaviancells199111.SternbergN;HamiltonDBacteriophageP1site-specificre-combination.I.RecombinationbetweenloxPsites198112.NagyACrerecombinase:theuniversalreagentforgenometailoring200013.SongDL;ChalepakisG;GrussPTwoPax-bindingsitesarerequiredforearlyembryonicbrainexpressionofanEngrailed-2transgene199614.ZinykDL;MercerEH;HarrisEFatemappingofthemousemidbrain-hindbrainconstrictionusingasite-specificrecombinationsystem199815.SorianoPGeneralizedlacZexpressionwiththeROSA26Crereporterstrain199916.ZambrowiczBP;ImamotoA;FieringSDisruptionofoverlappingtranscriptsintheROSAbetageo26genetrapstrainleadstowidespreadexpressionofbeta-galactosidaseinmouseembryosandhematopoieticcells1997

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