二硫键检测方法

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２。3.1．4MBP—Pｅrmatin蛋白中半胱氨酸残基及二硫键数目的测定L半胱氨酸可于5,5-二巯基双—2硝基甲苯（DＴNＢ)发生硫醇-二硫化物交换反应,在碱性条件下反应显黄色,在４12ｎｍ处有强烈吸收峰.该反应可特异地检测-SH,从而定量检测L半胱氨酸含量。分析ＭBP标签氨基酸序列可知,该标签蛋白中不含有半胱氨酸，故不影响原核表达的Peｒmatiｎ中半胱氨酸残基的数目.采用ＤＴNB方法测定样品的巯基数,其方法的主要步骤为:　　１)样品先用8　M尿素37℃处理4h;ﻭ　2)游离巯基数的测定:　向未经尿素处理的１.0ｍｌ样品(0.3８mｇ/ｍｌ）中加入2ｍlTrｉs—Ｇｌy(0。08６MTris,0.09MGly,pH8。0）,加入50μl　DTNＢ(１０mMDTNB，20０　mMTris—HＣｌ,pH　８.0),5min后测定412nm处的吸光值;3)　总的巯基数的测定:向经尿素处理的0．５mｌ样品中加入2ｍlＴｒis—Gｌy,加入5０μlβ-巯基乙醇（β-MＥ），37℃温浴1h,加入10　ml１2％三氯乙酸（TＣＡ）,37℃温浴１h,１1０00rｐm离心3０ｍiｎ,用５mｌ1２%ＴＣA重悬沉淀两次，以彻底去除β-ME,最后用2mlTris—Gly重溶沉淀,加入50μｌDTNB溶液,5　mｉｎ后测定４12ｎｍ处的吸光值。 利用公式:μmoｌSＨ/g=73。53×A４１２×Ｄ/C进行计算.其中Ａ412是412nm处的吸光值,　D为稀释倍数,Ｃ为蛋白浓度,　７3.５3是一个系数,由１06/１。36x1０４得到。