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1、中华人民共和国国家标准GB4789.42—2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布国家食品药品监督管理总局GB4789.42—2016前言本标准代替SN/T1635—2005《贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》。本标准与SN/T1635—2005相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验”;———标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”;———修改“操作步骤”;———增加“质量
2、控制要求”,可参见附录C;———删除“普通RT-PCR方法”。ⅠGB4789.42—2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验1范围本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1实时荧光PCR仪。2.2冷冻离心机。2.3无菌刀片或等效均质器。2.4涡旋仪。2.5天平:感量为0.1g。2.6振荡器。2.7水浴锅。2.8离心机。
3、2.9高压灭菌锅。2.10低温冰箱:-80℃。2.11微量移液器。2.12pH计或精密pH试纸。2.13网状过滤袋:400mL。2.14无菌棉拭子。2.15无菌贝类剥刀。2.16橡胶垫。2.17无菌剪刀。2.18无菌钳子。2.19无菌培养皿。2.20无RNase玻璃容器:见E.1.2。2.21无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。3试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。3.1GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。3.2过程控制病
4、毒的引物、探针:见A.1。1GB4789.42—20163.3过程控制病毒:制备见附录C。3.4外加扩增控制RNA:制备见附录D。3.5Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液:见E.2.2。3.65×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。3.7磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。3.8氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。3.9蛋白酶K溶液:见E.2.6。3.1075%乙醇:见E.2.7。3.11Trizol试剂:见E.2.8。4检验程序诺如病毒检验程序见图1。图1诺如病毒检验程序5操作步
5、骤5.1病毒提取注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置2~3个平行处理。5.1.1软质水果和生食蔬菜5.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)。5.1.1.2将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGBE溶液(软质水果样品,2GB4789.42—2016需加入30UA.niger果胶酶,或1140
6、UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒。5.1.1.3室温,60次/min,振荡20min。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整一次pH,延长振荡时间10min。5.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。10000r/min,4℃,离心30min。取上清至干净试管或三角瓶,用1mol/LHCl调pH至7.0。5.1.1.5加入0.25倍体积5×PEG/NaCl溶液,使终溶液浓度为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。60s
7、摇匀,4℃,60次/min,振荡60min。10000r/min,4℃,离心30min,弃上清。10000r/min,4℃,离心5min紧实沉淀,弃上清。5.1.1.6500μLPBS悬浮沉淀。如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min。10000r/min,4℃,离心15min,将液相部分仔细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。5.1.2硬质表面食品2)。记录擦拭面积。
8、将105.1.2.1将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(<100cm
