ELISA所需缓冲液的配方

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1、..-一、做ELISA确定抗原最正确包被浓度，做方阵滴定具体怎么做呢？选择好一份为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CBPH=9.6或1*PBPH=7.4进展倍比稀释〔8个条件〕后参加96孔板每孔100ul。〔一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进展试验选择〕4度过夜取出后甩干，参加20%NBS封闭每孔200ul。37度2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进展稀释〔倍比稀释4个梯度〕即可。棋盘滴定就是板酶穿插,同时带上阳性、阴性通过试验确定最正确P/N的包被搭配E的试验2．抗原和

2、抗体最正确工作浓度确实定 抗原抗体反响要求在最适比例条件下进展，ELISA反响试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进展最正确工作浓度的滴定和选择，以到达最正确的测定条件。 1〕方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进展包被、洗涤。按列分别参加用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反响后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴

3、性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。 　　方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)..word.zl-..-，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别参加强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l000、l:5000、l:10000三个浓度，分别参加每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反响，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适

4、条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最正确工作浓度。 二、ELISA最适工作浓度的选择及标准化操作1最适工作浓度的选择 1．1间接法测抗体     酶标抗体工作浓度的选择：①用IgG进展包被，洗涤。②将酶标IgG用稀释液作一系列稀释后分别参加已包被的孔中，保温、洗涤。③加酸终止反响后，读取吸光度(A)。读取A值在1．0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标IsC的工作浓度应为1／1 600。     棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度：①用包被液将抗原由1：50开场作比倍稀释后进展包被，洗涤。②将强阳性参考血清、弱阳性参考血清

5、和阴性参考血清用稀释液作1：100稀释，加样，保温、洗涤。③加按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反响后读取A值。⑤选择强阳性参考血清的A值为0．8左右、阴性参考血清的A值小于0．1的包被抗的稀释度作为工作浓度，从中选取最适工作浓度。 1．2夹心法测抗原     在夹心ELISA法中，可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。①抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10．0、1．0和0．1微克／毫升，分别在ELISA板上进展包被，每一浓度包括3个纵行，洗涤。②在1个横行各包被孔中参加强阳性

6、抗原液，另1横行参加弱阳性抗原液，第3横行参加阴性对照液，保温、洗涤。③将酶标抗体用稀释液稀释成3个浓度，例如1：1 000、1：5 000和1：25000。分别参加每个包被浓度的1个纵行中，保温、洗涤。④加底物显色。加酸终止反响后，读取A值。⑤以强阳性抗原的A值在0．8左右、阴性参考的A值小于0．1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选取包被抗体浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再进一步做棋盘滴定。 2测定方法的标准化 2．1加样     ELISA中除了包被外，一般需进展

7、96孔加样。定性测定中有时不强调加样量的准确性。例如规定为加样1滴，如不具备相当的条件，要尽量使用一样口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积根本一样。在定量测定中，加样量应力求准确，最好采用量程准确的微量移液器。加样时应将液体加在孔底，不要加在孔壁上部，防止出现气泡。 2．2保温     在ELISA中，一般在加标本和结合物后，反响的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为防止蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。如用保温箱，空湿盒应预先放在其，以平衡

8、温度。 2．3洗涤     洗涤在ELISA过程中不是反响步骤，但却是决定实验成败的关键。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中参加聚山梨酯一类物质即防止非特异性吸附，在ELISA中最为常用。ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：吸干孑L反