最新第十六章基因诊断技术及其应用教学讲义ppt.ppt

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1、第十六章基因诊断技术及其应用第一节基因诊断的策略第二节基因诊断的常用技术方法第三节基因诊断的应用第一节基因诊断的策略一、基因突变的检测当致病基因已和分子机制均确知时，直接检测和分析突变是分子诊断最有力和最准确的方法。基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、点突变(只有一种类型的点突变，或像N-ras突变那样，突变类型很多但只有一两种占优势，或发生在限制酶识别位点上使酶切位点消失，或发生在隐蔽位点上使酶切位点增加、异常基因重排和异常基因融合等的检测。较大片段用Southern印迹法

2、或PCR法。单个外显子突变采用双此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。㈡DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragnentlengthpolymor-phism,RFLP)分析在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少D

3、NA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。㈢等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。二、聚合酶链反应(PCR)(图16-2)根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因

4、片段扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。三、基因测序分离出患者的有关基因，测定出其碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。第四节基因诊断的应用一、基因诊断在恶性肿瘤中的应用㈠恶性肿瘤的特异性基因诊断在慢粒白血病中，具有t(9;22)染色体的易位及所产生的bcr-abl融合基因，因此可用检测特殊融合基因的方法进行某些白血病的诊断。在淋系白血病中存在大的Ig或TCR基因的V-(D)-J组合可作为B、T白血病的克隆标志。应用Southern杂交或PCR方法

5、可检测这些标志。㈡恶性肿瘤相关基因分析因此，通过对肿瘤相关基因的分析如癌基因，抑癌基因，凋亡和抗凋亡基因缺失，插入，扩增突变，表达过量。同样可对临床起到鉴别诊断、判断预后的作用，如对儿童神经母细胞瘤、神经上皮瘤所进行的鉴别诊断。神经母细胞瘤神经上皮瘤N-myc-mRNA表达高极低C-myc-mRNA表达无高㈢恶性肿瘤的分子病理学诊断原位杂交在肿瘤病理诊断中的应用至少包括如下几个方面：1. 肿瘤病毒的检出：肝穿刺查乙肝病毒2.肿瘤细胞遗传学改变的检测:FISH查标记染色体3.细胞内基因结构和量的改变的

6、检测：4.基因表达产物的检测RT-PCR原位杂交5.肿瘤分化程度的确定：RT-PCR定量分析查转录拷贝数6.实体瘤中抗药性肿瘤细胞的定位检测多重耐药基因（MDR1）基因扩增与表达的检测二、基因诊断在感染性疾病中的应用(表16-2)利用分子生物学技术，特别是PCR检验病毒感染，在临床诊断中具有特别重要的意义。PCR检验直接灵敏地探测病毒基因组或病毒基因转录产物，无需血清学检查，可进行早期诊断。三、基因诊断在遗传性出血性疾病中的应用血友病检测突变可用用RFLP、PCR-SSCP/DGGE，对片段缺失和插

7、入可用SouthernDNA印迹转移杂交法检测。两基因的突变热点都在CpG二核苷酸处。对血友病患儿可通过症状和家谱分析很快做出诊断。四、产前基因诊断基因诊断具有直接和灵敏的特点取绒毛、羊水、脐血，对于早期诊断遗传病和感染性疾病以及识别分子病理和监测病情发展具有十分重要的临床意义。近年来采用植入前诊断(PGD)结合体外受精技术(IVF)和胚胎单细胞穿刺技术，对单个胚胎细胞进行FISH或筑巢式PCR检测。目前，基因诊断主要运用于胎儿早期检测遗传病和研究监测某些致病基因携带者以期达到病前预测的目的。病因概

8、说一、病因的涵义二、病因学说涵义三、中医病因学的发展沿革四、中医病因学的特点五、病因分类一、病因的涵义：病因是指能影响和破坏人体阴阳相对平衡协调状态，导致疾病发生的各种原因。“凡人之所苦谓之病；所以致此病者，谓之因”。二、病因学说涵义研究和阐释致病因素的性质，致病特点和致病规律的一门学说。“凡治病，先须识因，不知其因，病源无目”三、中医病因学的发展沿革《周礼·天官》说：“夫天之寒暑，阴阳风雨晦明，既足以伤形；而人之喜怒阴阳，运于营卫之间交通则和，有余不中则病”。1、秦