感冒疏风颗粒微生物限度检查方法学验证

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1、感冒疏风颗粒微生物限度检查方法学验证　　摘要：目的：建立感冒疏风颗粒微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2010版的要求[1]，通过接种代表性的阳性菌株，用常规法、稀释法及薄膜过滤法对五株阳性菌株进行回收率测定。结果：该样品没有抑菌性，常规法、稀释法及薄膜过滤法对五株阳性菌株回收率均高于70%。结论：本样品细菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌大肠埃希菌均可采用常规法进行检查。关键词：感冒疏风颗粒；微生物限度检查；回收率；方法学验证中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2013）08-0059-02感冒疏风颗粒具有辛温解表，宣肺和中的功能[2]。临床用

2、于治疗风寒感冒，发热咳嗽，头痛怕冷，鼻流清涕，骨节酸痛，四肢疲倦。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌数计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定[1]。本文通过接种代表性的五株阳性菌株，采用常规法、稀释法及薄膜过滤法进行微生物限度检查方法学验证实验，为该样品建立了微生物限度检查方法。1仪器与材料51.1仪器HTY-2000A集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）；开放式集菌器（北京牛牛基因技术有限公司，批号：20101005）。1.2样品感冒疏风颗粒（云南雄业制药有限公司，规格/袋，批号20110101，20110102，2011

3、0103，20101001，20101105）。1.3培养基和试剂改良马丁液体培养基（批号，1011042），改良马丁琼脂培养基（批号，010315），玫瑰红钠琼脂培养基（批号，110208），营养肉汤培养基（批号，110120），营养琼脂培养基（批号，101224），胆盐乳糖增培养基（批号，101226），北京三药科技开发公司。1.4菌种大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（F）44102]、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、白色

4、念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]（中国药品生物制品检定所提供）2方法按中国药典2010版一部微生物限度检查法（附录XⅢC）[1]进行实验。2.1菌液制备取经34℃培养18～24h，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1mL，加入95mL0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7备用；取经24℃培养18～24h的白色念珠菌液体培养物1mL，加入9mL0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6备用；取经培养一周的黑曲霉菌斜面物，加0.9%氯化钠溶液3

5、mL，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊后，取1mL加入0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用。2.2菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌10-5～10-7稀释液各1mL，用45℃营养琼脂培养基20mL注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48h，计数，应约为50～100cfu/mL；取上述白色念珠菌10-5～10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1mL，用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20mL注皿，各平行测定两皿，23～28℃培养，逐日观察计数，应约为50～100cfu/mL。结果见表1。2.3供试液制备取样品10mg，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲

6、液100ml，用匀浆议混匀，作为1：10的供试液。2.4回收率的测定2.4.1细菌数霉菌数常规法测定试验组：取1：10供试液1mL、50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果。菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数（同菌液检验）。供试品对照组：取1：10供试液15mL加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24～72h逐日观察结果，测定供试品本底菌数2.4.2细菌数霉菌数稀释法测定试验组：取1：10供试液0.2mL/皿、50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养

7、24～72h逐日观察结果。菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数（同菌液检验）。2.4.3细菌数霉菌数薄膜过滤法测定取1：10的供试液1mL，注入开放式滤器（先用少量缓冲液润湿滤器），用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次100mL共4次（每次充分振摇滤器，总冲洗400mL），留有少量缓冲液加1mL（50～100cfu）试验菌混匀，抽干后，取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中，置规定温度培养48h，结果见表2。2.5回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率：试验组