cell culture 01 原代培养

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时间:2017-12-30

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1、基本操作技术和要求原代培养传代培养和细胞系的维持培养细胞生长状况的观察细胞冻存与复苏细胞培养污染的检测和排除基本操作技术和要求无菌技术目标—消除污染无论什么时间对培养物进行处理都要肉眼和显微镜仔细检查培养物培养物应在无抗生素培养基中生长一段时间,以发现隐藏的污染使用前,要亲自对试剂进行无菌检查培养及各种瓶子不能与其他人共用,且不能用于不同的细胞系任何时候都要保持无菌技术高标准培养室内的无菌操作工作的要求:有条不紊完全可靠•培养前的准备:制定好实验计划和操作程序书面准备:实验程序、试剂配制计划、所需物品操作准备:准备所需物品、清点注意考虑意外情况培养室和超净台的消毒培养室消毒超净台处

2、理•培养室0.2%新洁尔灭拖地•实验前乙醇擦洗•紫外照射30~50min•紫外消毒30min视情况而定,个人保护•用品放置不重叠•先乙醇消毒,再紫外灭菌洗手和着装原则上彻底洗手,按外科要求着装实验前手的消毒实验中手的消毒无菌衣的放置和处理不统一根据自己实验室的情况而定无菌培养操作用品布置有序、合理实验前,点燃酒精灯所有操作在火焰近处并经过火焰烧灼进行吸管不混用、不接触瓶口、向下倾斜放置瓶口不过早打开,不垂直放置烧灼:器械、移液管、培养瓶、胶塞、塑料用品吸管:放置方法、棉塞操作中:讲话、咳嗽创造无菌环境的各因素——安静的工作区域•减少人的过往和活动,与动物微生物培养区分•干净无灰,无

3、多余设备•不进行非无菌操作创造无菌环境的各因素——工作面洁净原则•开始工作前的洁净•只带针对某一流程所需物品,移走不需要物品•整理工作台,取物不跨越•中央有宽敞操作空间•在视野范围内工作•随时擦去任何溢出物,并用乙醇擦洗•实验完毕,移走物品,彻底清洗工作面创造无菌环境的各因素——个人卫生洗手可湿润手部,带走干的皮屑可戴外科手套,并时常擦拭消毒可不戴手套,提高灵敏度感冒尽量避免做实验指甲创造无菌环境的各因素——技术训练新手进入无菌工作区,技术和程序训练十分必要工作前,到训练有素的操作者那里进行3个月的学习数周的操作技能和基本理论知识一段不用抗生素的跟踪期换液—传代—原代的培养过程绘制

4、生长曲线训练无菌技术举例——更换培养基检查细胞,确定怎么处理处理工作台准备所需物品紫外灭菌将培养基等试剂瓶放于工作面取吸管,加吸头打开培养瓶,弃去旧培养基弃吸管换新吸管,加入新培养基弃去吸管,拧盖培养瓶放于培养箱,培养基放于冰箱清理物品,擦地面原代细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件,直接影响细胞的体外培养。取材的基本要求••1.取材要注意新鲜和保鲜••2.应严格无菌——准备和操作••3.防止机械损伤••4.去除无用组织和避免干燥••5.应注意组织类型、分化程度、年龄等••6.作好记录取材的基本器材和用品眼科剪、眼科弯剪直头镊、弯头镊手术刀无血清培养基或Hank

5、s液体小烧杯培养皿特殊用品各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材皮肤和粘膜的取材主要取自于手术过程中的皮片,方法似外科取断层皮片手术操作,但面积一般2~4平方厘米。尽可能去除皮下或黏膜下组织严格消毒,较高浓度抗生素溶液清洗内脏和实体瘤的取材•内脏除消化道外基本是无菌的,但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位,修剪去除不需要的部分。如血管、结缔组织等•实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域,要避开破溃、坏死液化部分,以防污染,尽量去除混杂的结缔组织。血液细胞的取材血细胞、淋巴细胞的

6、取材,一般多抽取静脉外周血,或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞,取材时应注意抗凝。肝素的使用:常用浓度为20U/ml抽血要严格无菌骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌,注意抗凝,还要尽快分离培养离心后,用无钙、镁PBS洗两次,再用培养液洗一次后即可培养不宜低温存放。鼠胚组织取材引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中5分钟(注意时间不能太长,以避免酒精从口或其他通道进入体内,影响组织活力)取出动物,在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢切开皮肤,用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮

7、肤用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾,把动物反包,暴露躯干更换无菌解剖器材,采用无菌操作法解剖取出胚胎。幼鼠胚肾(或肺)取材幼鼠采用上述方法处死消毒后腹部朝上固定在木板上切开游离毛皮并拉开至两侧采用无菌法打开胸腔取肺或背部朝上固定在木板上,先将背部毛皮切开游离并拉向两侧,然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。人胚体组织取材取材方法与鼠类相同鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材步骤(1)取孵化至适当胚龄(9~12天)的胚蛋,用照蛋灯在暗处灯检,若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋,说明胚体发育

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